一株产香微生物的筛选
2010-09-14 20:03:06   来源：本站原创   评论：0 点击：

李秀红　李　冰　李　仙　刘煜宇
(云南瑞升科技有限公司　昆明　650106)

摘　要：从胡萝卜中分离到了一株能降解β－胡萝卜素产香的真菌，通过GC－MS分析了其降解产物的挥发性成分，发现产物中含有二氢猕猴桃内酯，异佛尔酮，2，2，6－三甲基－环己烷－1－酮，α-环状柠檬醛，β-环状柠檬醛等烟草重要致香物质，其中二氢猕猴桃内酯含量为18%。相对于传统的合成工艺，本文为二氢猕猴桃内酯的生产提供了一条全新的途径。

关键词：胡萝卜素；二氢猕猴桃内酯；真菌；分离；降解；香料

Isolation of a strain producing aroma
Li-Xiuhong   Li Bing   Li Xian   Liu Yu-yu
(Yunnan Research Science & Technology Co. LTD, Kunming, 650106)

Abstract: A fungal was isolated from the carrot which can degrade β－carotene and produce aroma. The volatile organic compounds was analyzed by GC－MS, the important tobacco aromas Dihydroactinidiolide, Isophorone, 2,2,6-Trimethylcyclohexan-1-one, α-Cyclocitral and β-Cyclocitral were identified in the volatile organic compounds, and Dihydroactinidiolide covered 18%. In contrast to common ways to synthesize Dihydroactinidiolide, a novel ways was reported in this study.

Keywords: Carotene; Dihydroactinidiolide; Fungal; isolation; Degrassion; Aroma

　　类胡萝卜素是指胡萝卜素和叶黄素两大类色素的总称，有8个类异戊二烯单元组成。^[1]广泛的存在于果类（菠萝， 桔子， 柠檬， 葡萄， 草莓， 西红柿， 红辣椒等），鲜花（金英花,，水仙），以及一些昆虫和海洋动物，是一类重要的香料前体物质，^[2]其通过酶或光氧化可产生C-13,C-11,C-10,C-9衍生物，包括α－紫罗兰酮、β－紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯和β－大马酮等重要的香料物质。^[3]国外对酶或微生物定向降解β－胡萝卜素产香进行了研究。发现在水相中用多酚氧化酶，黄嘌呤氧化酶、lipoxygenase处理胡萝卜素可合成二氢猕猴桃内酯；H.Zorn等分离到了10株能降解胡萝卜素的菌种，二氢猕猴桃内酯是Ganoderma applanatum等转化β-胡萝卜素的唯一产物，而Ischnoderma benzoinumd的去菌体发酵液可将β-胡萝卜素转化成β－紫罗兰酮、β－环柠檬醛、二氢猕猴桃内酯等；^[4]A Sanchez-contreras等从万寿菊上分离到了两株菌（Eotrichum sp.和Bacillus sp.）混合发酵转化叶黄素，可形成7,8-二氢-β-紫罗兰醇, β-紫罗兰酮, 7，8-二氢-β-紫罗兰酮和3-氢-β-紫罗兰酮等。^[5]目前国内关于微生物发酵产香的文献较多，但尚无生物法降解β－胡萝卜素产香的相关报道，同时国内关于生物法产香，筛选菌株时缺乏明确的底物和目标产物，给工作带来很大的困难。
　　本文以β－胡萝卜素为底物，对具有降类胡萝卜素的微生物进行了筛选，同时对发酵产物的挥发性成分进行了分析。

　　1　材料与方法
　　1.1　实验材料
　　β－胡萝卜素（武汉远晨，95%）；GC/MS(FINNIGAN TOP 8000/VOYAGER)仪；样品南瓜、西红柿、辣椒等采自云南瑞升科技有限公司农场；各种花卉采自云南花鸟市场
　　基本培养基：1g KH₂PO₄, 2g (NH₄)₂SO₄, 0.5g MgSO₄, 0.01g FeSO₄, 1000ml H₂O, pH自然, 10g琼脂。
　　1.2　实验方法
　　1.2.1　菌种的筛选^[4]
　　125mgβ－胡萝卜素和12.5g土温40g溶于200ml二氯甲烷中，减压浓缩除去二氯甲烷，得到分散均匀的胡萝卜素，将其加入到于121℃灭菌30分钟1000ml基本培养基，倒平板。将所采样品用灭过菌的剪刀剪成小碎片，直接接种于预先倒好的筛选培养基平板上，30℃培养2d后，观察有无透明圈。从有透明圈的样品中挑取菌落稀释涂平板，挑出具有透明圈的单菌落接种到液体培养基中，在避光条件下复筛，观察。挑出阳性明显的摇瓶，同时蒸馏萃取后做挥发性成分分析。
　　1.2.2　同时蒸馏萃取
　　将发酵液250ml过滤后，放入同时蒸馏萃取装置一端的500ml圆底烧瓶中，加热；装置的另一端为盛25ml二氯甲烷的100ml圆底烧瓶，60℃下水浴加热，同时蒸馏萃取3h。二氯甲烷萃取液用无水硫酸钠干燥，置于4℃过夜，过滤，滤液倒入浓缩瓶中用Vigreux柱浓缩至约1ml，浓缩液用于GC-MS分析。
　　1.2.3　GC/MS分析条件
　　仪器：GC/MS(FINNIGAN TOP 8000/VOYAGER)，毛细管柱：HP-5MS(60M×0.32mm×0.25um)，进样温度：240℃，载气：He，流速：1ml/min，GC/MS接口温度：280℃，质谱扫描范围：35-455aum,离子源：EI源，电子能量：70ev。

　　2　结果与讨论
　　2.1　菌种的筛选
　　从富含类胡萝卜素的蔬菜和果类中对能降解胡萝卜素产香的微生物进行筛选，以筛选平板上透明圈的有无判断其降解微生物的能力。从各类花卉及胡萝卜上筛选到能降解胡萝卜素的真菌10种（如表1）。

　　2.2　降解产物的挥发性成分分析
　　由于HLB-F发酵液具有明显的香气特征，以HLB-F为实验菌种，进行降解β－胡萝卜素产香实验，对发酵液进行挥发性成析，结果如图：

  图1　HLB-F降解β－胡萝卜素产物的挥发性成分的总离子流图

表2　HLB-F降解β－胡萝卜素产物的挥发性成分

　　通过GC－MS共鉴定出挥发性成分26种，利用归一化测定了各种成分的相对百分含量，主要产物包括：二氢猕猴桃内酯（18.10%），异佛尔酮（0.27%），2，2，6－三甲基－环己烷－1－酮（0.34%），α-环状柠檬醛（0.43%），β-环状柠檬醛（0.65%），均为β－胡萝卜素C-9,C-10,C-11衍生物。其结构式如图：

　　图2　HLB-F降解β－胡萝卜素产物的挥发性成分结构示意图1、二氢猕猴桃内酯，2、α-环状柠檬醛，3、β-环状柠檬醛，4、异佛尔酮，5、2，2，6－三甲基－环己烷1－酮.
　　这些主要产物与H.Zorn等报道的基本相同，^[4]均为烟草中重要的致香物质。二氢猕猴桃内酯作为一种重要的香料是HLB-F降解β－胡萝卜素的最主要的产物，具有猕猴桃样的清香、果香，可赋予卷烟烟气清甜、木香和凉香，柔和烟气。^[5，6]国内二氢猕猴桃内酯的研究主要集中在化学合成方面，^[7～9]本文通过筛选产香微生物降解β－胡萝卜素，可以定向合成二氢猕猴桃内酯，为二氢猕猴桃内酯的合成提供了一条新的途径。

参考文献
[1]王业勤,李勤生.天然类胡萝卜素——研究进展、生产、应用[M].中国医药科技出版社,1997
[2]John C. Carotenoids as Flavour and Fragrance Precursors. Leffingwell reports,2002,2(3):1～[3]Marie-Francoise Nonier, Nathalie Vivas De Gaulejac. Characterization of Carotenoids and Degradation Products in Oak Wood. Incidence on the Flavour of Wood. C.R.Chimie,2004,7:689~698
[4]G Maldonado-Robledo, E Rodriguez-Bustamante, A Sanchez-Contreras. Production of Tobacco Aroma From Llutein. Specific Role of the MicroorganismsInvolved in theProcess. Appl Microbial Biotechnolo,2003,62:484~488
[5]A Sanchez-contreras, M Jimenez, S Sanchez. Bioconversion of Lutein to Products with Aroma. Appl Microbial Biotechnolo,2000,54:528~534
[6]毛多斌,马宇平,梅业安. 卷烟配方和香精香料[M].化学工业出版社,2001
[7]晏日安,苏镜娱,曾陇梅等.二氢猕猴桃内酯的合成研究[J].中国医药工业杂志,1999,30（8）：338～340
[8]晏日安,苏镜娱,曾陇梅等.二氢猕猴桃内酯的合成研究（Ⅱ）[J].中山大学学报（自然科学版）,1999,38（4）：126～129
[9]陈永宽,孔令川,杨伟祖等.二氢猕猴桃内酯的合成及作为卷烟香料的应用[J].中国烟草学报,2003,9（2）：10～12