TCA沉淀方法
2010-05-26 22:54:42   来源：不详   评论：0 点击：

培养基上清直接电泳跑出来的条带经常很难看，可以TCA沉淀浓缩后跑电泳，一般表达量大于1mg/ml可以看到明显条带，这是我用的TCA沉淀方法，效果很好：
1.菌液10000g,离心5分钟，收集表达上清。
2.取500-1000ul上清于EP管中，加入1/9体积的100％TCA，颠倒10次混匀。
3.样品置于冰浴中大于0.5小时，过夜效果更好。
4.15000g,离心10－20分钟,可见有棕黑色沉淀，倒掉上清，将EP管倒扣在吸水纸上轻轻控几下，除去残余在管口的液体。
5.将EP管倒置于吸水纸长，37度烘箱10－20分钟，待管底无明显液体残留，如果管壁还残留有液体，可以吸水纸吸掉。可以改成室温或用电吹风，关键是除去管底和管壁残余液体。
6.15000g,离心10－20分钟,用20ul枪头尽量吸去管底残余的液体，此步骤要快，不然沉淀容易散开，降低蛋白回收率，一般最多几ul或者没有，注意不要吸到沉淀。
7.EP管倒置于吸水纸长，37度烘箱5分钟，确认管壁和管底没有液体残留。
8.加入20－50ul Loading buffer，95度加热10nim，一般沉淀会自动溶解，如果不溶，用手指轻弹管壁或用20ul枪头轻轻吸打，注意整个操作尽量不要碰到管壁，因为管壁可能沾有残余TCA。如果蓝色的Loading buffer不变成黄色，说明残余TCA吸弃了干净，如果变黄，一般不影响电泳。此方法连丙酮洗这一步都省了，而且不影响电泳效果。
或者第5步和第6步改为丙酮洗:
5.加入200ul冰冷的丙酮，用手指轻弹EP管，洗去管底和管壁残余的TCA。
6.15000g,离心10－20分钟,倒掉上清，将EP管倒扣在吸水纸上轻轻控几下，除去残余在管口的液体。