中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质，如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。
精制阶段：除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。
分离方法的选择
根据蛋白质的特殊性质采用不同的分离方法：
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蛋白质的性质 |
方法 |
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电荷（等电点） |
离子交换（IEX） |
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分子量 |
凝胶过滤（GF） |
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疏水性 |
疏水（HIC）反相（RPC） |
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特异性结合 |
亲和（AC） |
每一种方法都有分辨率、处理量、速度和回收率之间的平衡。
分辨率：由选择的方法和层析介质生成窄峰的能力来实现。总的来说，当杂质和目标蛋白性质相似时，在纯化的最后阶段分辨率是重要因素。
处理量：一般指在纯化过程中目标蛋白的上样量。如上样体积、浓度等。
速度：在初纯化中是重要因素，此时杂质如蛋白酶必须尽快除去。
回收率：随着纯化的进行渐趋重要，因为纯化产物的价值在增加。
在三阶段纯化策略中每一种方法的适用性见下表：
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技术 |
主要特点 |
捕获 |
中度纯化 |
精制 |
样品起始状态 |
样品最终状态 |
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IEX |
高分辨率
高容量
高速度 |
★★★ |
★★★ |
★★★ |
低离子强度
样品体积不限 |
高离子强度或pH改变。
样品浓缩 |
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HIC |
分辨率好
容量好
高速度 |
★★ |
★★★ |
★ |
高离子强度
样品体积不限 |
低离子强度
样品浓缩 |
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AC |
高分辨率
高容量
高速度 |
★★★ |
★★★ |
★★ |
结合条件特殊
样品体积不限 |
洗脱条件特殊
样品浓缩 |
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GF |
高分辨率
（使用Supedex） |
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★ |
★★★ |
样品体积（<总柱体积的5%）和流速范围有限制 |
缓冲液更换（如果需要）
样品稀释 |
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RPC |
高分辨率 |
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★ |
★★★ |
需要有机溶剂 |
在有机溶剂中，有损失生物活性的风险 |
提示：
1、 通过组和各种方法使纯化步骤之间的样品处理减至最少，以避免需要调节样品。第一个步骤的产物的洗脱条件应适宜于下一个步骤的起始条件。
2、 硫酸铵沉淀是常用的样品澄清和浓缩方法，所以HIC是捕获阶段的理想方法。
3、 GF很适宜在由浓缩效应的方法（IEX、 HIC、 AC）后使用，凝胶过滤对上样体积有限制，但不受缓冲液条件的影响。
4、 在捕获阶段选择对目标蛋白具有最高选择性或／和处理量的方法
5、 如果对目标蛋白的性质了解甚少的情况下，可采用IEX-HIC-GF的方法组合作为标准方案。
6、 只要目标蛋白耐受的情况下，可以考虑采用RPC方法用于精制阶段。
注：应该指出，三阶段纯化策略不是说所有的策略都必须是三个纯化步骤。所用的步骤数目取决于纯度要求和蛋白的最终用途。
