蛋白质的测定方法几则
2007-10-17 23:30:53   来源：发酵科技通讯   评论：0 点击：

1紫外吸收法
1.280mm光吸收法取3ml蛋白质溶液,以缓冲液作为对照。用光径为lcm的石英比色杯,在280nm处测定光吸收值。通常以浓度lcm蛋白质/ml溶液的A280为1.0进行估算。若已知该蛋白质的文献值,可直接计算出样品溶液中蛋白质的浓度。
2.280nm和260nm的吸收差法若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的核酸类物质,在用A280来测定蛋白质浓度时,会有较大的干扰。由于核酸在260nm的光吸收比A280更强,因此可利用280nm及260nm的吸收差来计算蛋白质的浓度。
常用下列经验估算:
蛋白质浓度(mg/m1)=1.45A280-0.74A260假设1mg蛋白质/ml溶液的A280为1.0。3.215nm和225nm的吸收差法蛋白质的肽键在200～250nm有强的紫外光吸收,其光吸收强弱在一定范围内与浓度成正比,且波长越短光吸收越强。若选取215nm可减少干扰及光散射,用215nm和225nm光吸收差值与单一波长测定相比,可减少非蛋白质成分引起的误差。因此,对稀溶液中蛋白质浓度的测定可用215nm和225nm光吸收差法。
常用下列经验公式:蛋白质浓度(mg/ml)=0.144(A215-A225)测定范围为20～100μg蛋白质/ml。
2双缩脲法
1.常量双缩脲法蛋白质含有多个肽键,因此有双缩脲反应,在碱性溶液中蛋白质与铜离子形成紫红色化合物,可在540nm处比色程度,其颜色深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质的分子量及氨基酸组成无关。本法测定范围为1～l0mg蛋白质/ml。
2.微量双缩脲法该法显色原理与常量双缩脲法相同。由于铜与蛋白质复合物的最大吸收峰在260~280nm,但在此区域干扰因素及空白的吸收都很大,而在310～330nm测定时干扰因素少一些,比540nm灵敏10倍以上。因此可选用310nm进行比色测定,测定范围为0.1～1.0mg蛋白质/ml;或用330nm测定,测定范围为0.2～2.0m蛋白质/ml。
3福林-酚试剂法
Folin法是Lowry在1951年建立的,是目前应用最多、使用最广泛、研究最深入的蛋白质测定方法。这方法是双缩脲反应的发展,它结合了双缩脲反应法中铜盐反应与Folin试剂反应的特点,首先在碱性溶液中形成铜与蛋白质复合物,然后该复合物通过芳香族氨基酸残基、酪氨酸和色氨酸残基的迅速反应及肽链或极性侧链或两者的铜络合物较慢的反应,而把磷相钼酸、磷钨酸色团还原成深蓝色,在750nm处读A750的光吸收值。此颜色反应和蛋白质含量在一定范围内成线性关系。本法可用750nm比色测定,范围为0.03～03mg蛋白质/ml;或500nm比色测定,范围为0.050.5mg蛋白质/ml。本法的标准曲线线性较差,样品浓度需按标准线校正。
4 BCA法
在碱性溶液中,蛋白质将二价铜(CU+2)还原成一价铜(CU+)后者与测定试剂中BCA[bicinchoninic acid双辛丹宁](金鸡宁)生成一个在562nm处具有最大光吸收的紫色复合物。复合物的光吸收强度与蛋白质浓度正比。此法测定范围100～1200μg蛋白质/ml。BCA法操作简单,灵敏度虽与Folin-酚法相似,但它的试剂十分稳定,因此对时间控制不需那么严格。显色后,1h内读A56值无变化。抗试剂干扰的能力强。