如何把真核表达的蛋白纯化出来等
2010-05-26 22:49:03   来源：不详   评论：0 点击：

52) 问一个可能是比较业余的问题，现在我想通过真核表到得到纯的蛋白，然后打单抗，但是很多人告诉我真核表达最大的问题就是得到的蛋白非常难纯化，很多人都这样说，所以科室里就没有人去试，实际上我觉得通过真核表达得到纯蛋白是最好的途径，所以想问一下，怎么样能把真核表达的蛋白纯化出来，谢谢。
纯化和表达系统有一些关系，但是最重要的还是看蛋白的特性，所以不一定真核就不好纯化，所以我觉得不用担心。纯化的方法你可以用离子交换等纯化方法，具体很难说，得看你的目标蛋白而定。

53) 你好,我想请教一下,我现在在做包涵体蛋白的柱上复性和纯化,是上的疏水柱.疏水上柱要求硫酸铵的浓度在1.75M以上,但是高浓度的硫酸铵在6M的盐酸胍中不能溶解,不知道你是否碰到过这类问题.而且我的蛋白又不能用8M的尿素溶解.缓冲液现在用的是50mM的磷酸二氢钠,PH7.5.还想请教一下,上样的浓度有要求么?不知道你有什么好的建议呢,谢谢.
要复性你的蛋白浓度就不能高，这样你溶解你的目标蛋白也就不需要那么高的盐酸胍了，这样你就可以把盐浓度提高点。上样浓度应该小于0.1mg/ml，具体情况得看你的蛋白，我建议你可以用简单点的稀释复性或者透析试试，如果不是特别复杂的复性最好能用简单的方法，别过柱子。

54) 不好意思，什么叫穿透啊？不懂唉，请指教。
另外，我还想问一下“交换纤维素解离基团的pK值”？，“用阴离子交换纤维素时要选用低于pK值的缓冲液，用阳离子交换纤维素时要选用高于pK值的缓冲液。”是什么意思，谢谢！

所谓穿透就是上样后用及平衡缓冲液洗下来没有被吸附的部分叫穿透,pK值用于表示酸碱性的强弱,阴离子交换的填料是碱性的,所以你需要用用缓冲液pH小于pK值这样它才能带正电荷,用于交换带负电荷的样品,否则就挂不上样品.而阳离子是需要缓冲液pH高于pK值,这样它才能解离带负电荷,用于吸附带正电荷的样品.否则也挂不住.

55) 我做得GST融合纯化，目的蛋白在66KD附近，但每次纯化出来的总有杂带，特别是最近的一条带，浓度较大，不论降温还是改变诱导剂浓度始终去不掉，您有什么高见，谢谢。
这样纯化的蛋白可以免疫动物,没有问题

56) 向您请教一个问题，我用pET28载体、宿主菌BL21(DE3)表达目的蛋白，目的蛋白的两端都带His-tag,蛋白的大小为37kD，在利用Ni-NTA纯化时总是在目的蛋白带旁边伴随一条带去除不了，请问有什么高招可以解决这个问题？!!!此外，该表达产物为包涵体，请问这种产物可不可以直接用来制备抗体？谢谢！！！

也许这两个都是你要的目标蛋白呢,会不会是这样呢,你可以用his的抗体做WB看看是不是这样的,如果是,那说明是这样的情况.此外你可以再平衡缓冲液中加0.5%的吐温等表面活性剂,这样可以去除一些非特异吸附,此外你可以用pH45左右的变性溶液去洗,这样也能去掉一些杂质,最后在用咪唑溶液洗脱.如果你这样都去不掉,而做WB也有两条带,那说明可能是降解,超声破碎的时候功率别太大,时间也别太长,注意温度,因为超声有时候也可能会使蛋白降解.

57) 我做得GST融合纯化，目的蛋白在66KD附近，但每次纯化出来的总有杂带，特别是最近的一条带，浓度较大，不论降温还是改变诱导剂浓度始终去不掉，您有什么高见，谢谢。
你可以在你的平衡缓冲液里加一些盐,0.2-0.5MNaCl,这样可以降低一些因为离子作用带来的非特异吸附.同时在平衡液里加0.5%吐温等表面活性剂,这样是不是有点改善,此外你也可以用阶段洗脱的方法,例如用5mM和10mM还原谷胱甘肽去分别去洗脱,这样看看有没有什么区别.此外还要注意的问题是超声破碎时注意功率和时间.避免过强时间过长,降解蛋白.
此外你可以GST抗体做WB看是不两个都是你要的东西，会不会是降解或造成这样的结果。你可以加点酶的抑制剂，此外抱歉我不是主任，嘿嘿。

58) 我准备用30％－60％硫酸铵沉淀透析、离心后去上phenyl－sephorase柱。但发现活性大部分还在沉淀中。测了一下蛋白浓度是20mg/ml。是不是浓度太高啊？
30％－60％硫酸铵沉淀可能对你的目的蛋白来讲，太粗略了，如你所言，目的蛋白可能在沉淀中，可否分级沉淀，３０％－５０％，５０％－６０％，再测一下活性可能就分开了，20mg/ml的蛋白浓度对于层析是有点高，洗脱液浓度变化或PH的改变都会使蛋白有损失，最好不要超过１０mg/ml。

59) 我的蛋白是用pGEX-4T载体在BL21中表达的，表达量很高，形成包涵体，为了获得可溶性蛋白，我现在尝试用较低浓度的诱导剂诱导，此前用不同浓度诱导做过对比，电泳后表达量的差异不大；但当我再降低温度诱导后发现，超声处理后的上清液中目的蛋白条带很微弱，大部分目的蛋白还是在沉淀中；这和我降低诱导剂前做的不一样（同温度），为什么目的蛋白的可溶表达会不稳定呢？对同一菌种应该是固定的吧？我很迷惑．
另外，请问，一般情况下２８度，３０度诱导时间应该分别多少才合适？我们的光度计出了点问题，无法测定ＯＤ值．谢谢．
还有，你有没有较好的蛋白纯化的文献介绍几篇，好吗？

60) chromatography 兄，请教一个问题:
选择填料的时候，CM和SP怎么选择？什么时候选择弱阳？什么时候选择强阳？
再问一个：
我们实验室有两种蛋白，一种等电点5左右，另一种等电点9左右，为什么都可以用CM阳离子交换纯化？（用的缓冲液都呈中性）
等电点5的那个我觉得选择阴离子交换柱好些，为什么不这样？
没有什么特别的原则，重要是纯化的效果好就可以，一般都是先选择弱的．
纯化是把目标蛋白和杂质分开就可以，所以其实在这样的情况下，酸性蛋白是挂在阴离子柱上，而后面的挂不住，但是只要能把它们和杂质分开就可以．所以酸性蛋白流穿，杂质被吸附也可以，所以不一定非要吸附也可以．


61) 我准备用30％－60％硫酸铵沉淀透析、离心后去上phenyl－sephorase柱。但发现活性大部分还在沉淀中。测了一下蛋白浓度是20mg/ml。是不是浓度太高啊？

也不是，其实沉淀你可以做仔细点，例如先用３０％沉淀，取上清，再把上清加到４０％，然后如此类推，一直到６０％，然后测定沉淀和最后上清的活性，这样就知道哪样的浓度沉淀效果比较好，既然你的活性都在沉淀里，那直接溶解在一定浓度的盐中，直接过滤上柱子就可以，浓度高也没有关系．

62) 急问：我的样品蛋白液本来放在４C保存，谁知有人把温度调到了１８C已有一天，请问这样对蛋白会有多大影响？我纯化的是一种酶。另外，树脂在这样的温度下性质会有所改变吗？某人说４C－３０C的情况下，树脂不会有太大改变。是这样么？谢谢！
不知道你的蛋白稳定不稳定，你可以测定一下活性看看，如果没有什么变化，那就没有关系，树脂不会因为温度有什么变化的，尤其是你的树脂不是以蛋白为配基的亲和填料．，没错在４C－３０C的情况下是没有多少改变，但是那也看多长时间，什么树脂，因为时间长会长菌如果不加抑菌措施的话．

63) 我用鼎国的sepharose 4-B 合成亲和柱可以吗？
是活化好的吗，还是普通的琼脂糖，他们的填料颗粒有的比较粗，不知道你选择的粒径是多少范围的，最好要细一些，４５－１６５um比较好，用一般应该没有问题．

64) 比如说，sephadex G-25的分级范围是1000～5000，我想问一下，分子量小于1000的分子（例如盐）是怎么样通过的？它是从凝胶内部通过吗？不是说只有1000～5000大小的分子从凝胶内部通过吗？
凝胶的中间有的是大小不同的孔,盐自然在这些孔中间通过,而所谓的分离范围也只是说在这样的分子范围内有差别,离开这个范围就没有分离效果,所以小的和大的都没有什么分离效果,因此不是只有1000～5000大小的分子从凝胶内部通过.而是在这个范围的分子有分离效果.

65) 请教：要从发酵液中纯化出一个分子量约为1100的具有抗菌活性7肽，前期的提取采用的是酸沉醇提的方法，粗提物中蛋白含量39mg/ml。资料上说，纯化这个小肽要用sephadexLH-20，可是我没有。：（尝试用sephadax G15 进行了纯化，出现了五个没有分开的峰，第六个峰分的还算可以。考虑到可能是粗提物中的组分太多，于是对粗提物用sephadex G200进行了纯化，得到一个单一峰，收集后，冷冻干燥，再过sephadex G50，得到两个吸收峰，可是实验发现，这两个吸收峰没有抑菌活性了：（洗脱液用的是pH7.0的PBS，检测波长280nm。请问可能出现的问题有哪些？洗脱液选择的有问题？检测波长有问题？｛我的这种多肽，资料上说HPLC的检测波长为210nm,也有205nm的。｝

你的问题很不明确,用sephadexLH-20纯化除了有一部分凝胶过滤外,还有一些分配色谱的作用,所以这个介质和sephadax G15 是不太一样的,你纯化出多少峰都应该进行抑菌实验,否则很难知道你要的组分在哪里.既然这个分子量这么小,那你上sephadex G200,估计你的目标多肽在最后面,所以你得到的那个峰不一定有你要的东西,而在后面,我是这样猜测的,关键你要测定活性,所以你再纯化也没有活性,问题在于你没有时时做活性检测,填料选择不很正确,检测波长我不清楚对不对,关键你要选择合适的柱子,同时每一步都做活性检测.

我确实是对每个峰都作了抑菌实验,Sephadex G15的每个峰都有抑菌活性.粗提物上G200只得到了一个吸收峰,要是我要的组分在后面,可它连个小峰都没有呀.。此外，有人建议我，先使用硅胶柱对粗提物进行处理，请问可供选择的柱子有哪些？谢谢。

那你没有说明G200的峰是不是有活性，你也可以考虑硅胶填料，那得选择c8或者c4的反相硅胶的柱子，可以做HPLC，这样也是不错的选择，毕竟通常的凝胶柱子很难有很好的分离效果。