利用工农业废水开发微生物发酵
2007-10-10 22:12:25   来源：本站原创   评论：0 点击：

　　随着我国经济建设的快速发展,工农业生产发展迅速,同时也出现了制约发展的两大因素,即资源短缺和环境污染。我国资源短缺且有限资源不能高效利用;环境污染,尤其是水体污染日益加剧,严重阻碍了生产发展,影响了生活。工农业生产中产生的废水是主要的污染源之一,如啤酒、味精发酵废水,沼气发酵废液等。生产啤酒和味精的原料主要是谷物类淀粉、蛋白质、氨基酸等。其产生的废水中含有大量的淀粉、植物蛋白和氨基酸等营养物质[1],沼液中也含有丰富的营养元素[2],如按过去采用机械、物理和化学的方法处理这些废水,不但成本高、难处理、达不到排放标准而污染环境,还不能充分利用其中的营养物质,造成浪费。在利用废水培养微生物进而处理废水方面国内有一些研究报道。有人在利用啤酒废水养殖螺旋藻[3]、培养单细胞蛋白(SCP)[4]方面作过尝试;在利用味精废水培养微生物方面主要集中在培养、驯化苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株,达到既处理废水又生产生物农药[5,6]的目的;利用沼液培养微生物并发酵生产生物农药目前尚未见报道。
本研究试图利用啤酒、味精废水、沼液等工农业废水作为主要成分研制微生物发酵培养基发酵培养真菌、细菌和链霉菌。实现既处理废水又能废物利用,培养目标菌生产生物农药。
1　材料和方法
1·1　材料
发酵菌种:灰色链霉菌西藏变种(Streptomycesgriseusvar. xichangensis, TAS-1 )、交链孢菌(Alternaria alternata,缩写为AA,下同)、弯孢菌(Curvularia lunata, CL)。HX-0501 (乳黄色细菌,未鉴定)、井冈霉素菌(Streptomyces hygroscopicusvar. jinggangensis Yen)、阿维菌素菌(Streptomycesavermitilis)。供试病原菌:稻瘟病菌(Magnaporthe griseaBarr)、纹枯病菌(Rhizoctonia solaniKühn)、叶鞘腐败病菌(Sarocladium oryzae)、恶苗病菌[Gibberellafujikuroi( Sawada) Wollenw]、兰花炭疽病菌(Collectotrichumsp)等。除井冈霉素菌由浙江桐庐汇丰生物化工有限公司提供,阿维菌素菌由浙江升华拜克生物股份有限公司提供外,其它菌均为本研究室分离保存。液体发酵培养基质:啤酒废水培养基(PJ)、味精废水培养基(WJ)、沼液培养基(ZY)、马铃薯蔗糖(葡萄糖)培养基(PD)。
1·2　方法
1·2·1　废水培养基的制备
沼液培养基:按沼液与水体积比为1∶3~6进行稀释,用HCl或H2SO4、NaOH或Ca (OH)2调节pH值至6·5~7·2,然后按重量/体积的组分进行配制(下同):葡萄糖或蔗糖1·0%~3·0% (g/ml)、尿素1·0%~1·5% (g/ml)、K2HPO40·05%~0·1%(g/ml),以及常用和常规量的无机盐、微量元素。啤酒废水培养基:按啤酒废水与水体积比为1∶4·5~5·5进行稀释,调节pH值至6·5~7·2,葡萄糖或蔗糖1·0%~2·0% (g/ml)、尿素1·0%~2·0% (g/ml)、K2HPO40·05%~0·1% (g/ml),以及常用和常规量的无机盐、微量元素。味精废水培养基:按味精废水与水体积比为
1∶4~6进行稀释,调节pH值至6·5~7·2,葡萄糖或蔗糖1·5%~2·0% (g/ml)、淀粉2·0%~3·0%(g/ml)、K2HPO40·05%~0·1% (g/ml),以及常用和常规量的无机盐、微量元素。上述无机盐为CaCO3、MgSO4、KCl,添加量为0·1%~0·15% (g/ml);微量元素为:维生素C、ZnSO4、FeCl3,添加量为0·03%~0·05% (g/ml)。
PD发酵培养基: 200 g去皮马铃薯切块加1 000ml水煮沸20 min,过虑取煮液用水补足1 000 ml,加18 g葡萄糖(或蔗糖)。
1·2·2　菌种及发酵培养基准备
保存在冰箱中的上述各菌种移入PDA平板培养基上培养5~6 d备用。啤酒、味精废水和沼液培养基分别取200 ml装入500 ml三角瓶中,用“妙洁”牌PE保鲜锡膜封口,在121℃、0·15 MPa高温高压下灭菌30 min,取出冷却备用。
1·2·3　真菌、细菌、放线菌利用废水培养基试验
AA菌、CL菌、HX-0501菌、TAS-1菌、井冈霉素菌和阿维菌素菌各取直径7 mm的菌块5块,分别接入上述灭菌培养基中,以不接菌的培养基为空白对照,用锡膜封口,锡膜用接种针打7个小孔以利通气。接种后的三角瓶置空气恒温摇床,在28±0·5℃、125~130 r/min振荡发酵培养7 d,观察发酵液浊度、利用情况、真菌菌丝团大小、测定菌丝团重量。
1·2·4　发酵滤液生物测定
前期的对峙培养生物测定已证实, TAS-1和HX-0501菌主要靠分泌代谢物(孢外物质)抑制病原菌。TAS-1和HX-0501菌在啤酒、味精、沼液废水及PD发酵培养基中的发酵液在13 000 r/min高速离心15 min,滤出上清液备用。吸水滤纸浸发酵原液对峙培养测定:将7 mm直径灭菌吸水滤纸浸吸发酵原液,放入PDA培养基平板,距吸水滤纸15 mm处接种7 mm直径供试菌,置28℃恒温培养,在5 d和7 d (纹枯病菌在1d和3 d)测量菌落直径。发酵原液稀释测定:用灭菌冷却到40℃左右的PDA培养基将TAS-1和HX-0501菌发酵离心上清液稀释,分别配成10倍、50倍和100倍的发酵液PDA培养基。倒入直径为90 mm灭菌培养皿中,制成不同浓度发酵上清液的PDA平板,以不加发酵液的PDA为对照。将直径7 mm的供测病原真菌菌块接入上述平板中央,置28℃恒温培养,在5 d、7 d (纹枯病菌在1 d、3 d)测定菌落直径,计算抑菌率。测定对稻瘟病菌、纹枯病菌、叶鞘腐败病菌、恶苗病菌、兰花炭疽病的抑菌效果。
2　结果与分析
2·1　废水发酵培养基利用试验
测定结果(表1)表明, AA和CL菌能很好的利用啤酒、味精废水和沼液为主要基质的培养基,发酵培养后产生大量的菌丝团(球),菌丝球黄褐色到黑色、直径大小不等。CL菌在3种废水发酵培养基中生长情况好于AA菌。培养液由发酵前的浑浊状,变成浅黄至金黄色清澈的液体,对废水起到净化作用。TAS-1和HX-0501也能利用3种废水培养基进行发酵培养。HX-0501菌在啤酒、味精废水和沼液培养基中形成大量浑浊状细菌,颜色由乳黄色到浅黄色。TAS-1在上述3种废水培养基中发酵,产生大量细小的放线菌球,菌球乳黄色到浅黄色,发酵液浅黄至金黄色。但井冈霉素菌和阿维菌素菌不能利用啤酒、味精废水和沼液培养基进行发酵培养。
2·2　TAS-1和HX-0501发酵滤液的生物测定
2·2·1　原液对峙测定
先用发酵滤液原液采用对峙培养法测定对水稻稻瘟病菌、纹枯病菌、恶苗病菌、叶鞘腐败病菌,兰花炭疽病菌和叶斑病菌的拮抗作用。从图1显示, TAS-1在啤酒、味精和沼液培养基中发酵原液对稻瘟病菌、纹枯病菌、炭疽病菌和叶斑病菌的拮抗作用较强,抑制率均在80%以上、对恶苗病菌和鞘腐病菌稍差,抑制率在63%~77%TAS-1在PD培养基中发酵原液对炭疽病菌抑制率在80%以上外,对其他5个病原菌抑制率均在80%以下。
　　从图2显示, HX-0501在4种发酵培养基中发酵原液对稻瘟病菌的抑制率超过80%,在啤酒味精和沼液培养基中发酵原液对纹枯病菌、鞘腐病菌、炭疽病菌和叶斑病菌抑制率在75%~82%,对恶苗病菌较差,抑制率为68·8%~73·8%。在PD培养基中发酵原液除对稻瘟菌抑制率为81·2%外,对其他5个病原菌抑制率在67·5%~70·5%。
2·2·2　发酵原液稀释测定
从表2可见, TAS-1在啤酒、味精和沼液中的发酵原液稀释10倍和50倍时,培养7 d (纹枯菌3d)对稻瘟菌、恶苗菌和纹枯菌的抑制率在59·8%~82·2%,在PD中的发酵液抑菌效果比啤酒、味精和沼液中的稍差。TAS-1在4种培养基中的发酵原液稀释100倍后对供试的所有菌抑菌率菌明显下降。HX-0501在啤酒、味精、沼液和PD培养基中发酵原液稀释10倍对稻瘟菌、纹枯菌和恶苗菌拮抗沼液较强,稀释50倍后效果有所下降,稀释10倍后抑菌效果下降明显。HX-0501对纹枯菌的拮抗作用强于TAS-1,结果见表3。未测定AA、CL菌发酵液对作物病原菌的拮抗作用。

3　讨论
　　我国是世界第一大啤酒和味精生产国。年产啤酒3 000万t,每生产1 t啤酒平均排出约15 m3废水,目前每年生产啤酒产生的废水在4·36亿t以上。目前我国味精产量约130万t。每年生产味精排出的废水达3 250万t左右。沼气是解决我国农村能源、改善环境卫生、保护森林、提高农民收入的可循环利用生物质能。到2005年,全国农村新型沼气池总量超过2 000万户(个),每池体积平均8m3,大型沼气池3万多个,总容量超过1·6亿m3,全国每年产出沼肥(沼渣、沼液) 2·5亿t左右[2]。啤酒发酵废水中主要污染因子是化学需氧量(CODCr)、生化需氧量(BODs)和悬浮物(SS)。其浓度含量为CODCr1 000~2 500 mg/L、BODs 600~1 500 mg/L、SS 300~600 mg/L、TN 30~70 mg/L(不同厂家浓度不同), pH值为4·5~7·0 (显微酸性)。味精废水中CODCr含量高达4万~8万mg/L、BODs 2万~3万mg/L、SS为1万~2万mg/L、菌体1·0%~1·5%、总氮约1·0%。味精废水中有机物含量较高,有大量的氨态氮和硫酸根等, pH值约3·0~3·4,是高浓度酸性有机废水。沼液中含有丰富的营养元素,在1 kg沼液中,含有全氮0·81 g,全磷0·04 g,全钾2·53 g;速效氮0·26 g,速效磷0·04 g,速效钾0·47 g,还含有多种微量元素、氨基酸、激素和维生素等物质[2]。这些废水如不能得到很好处理就直接排放,将对生态环境造成严重污染,同时也浪费了大量资源。TAS-1是从西藏高原土壤中分离到的一株特异灰色链霉菌,其活体和代谢产物对多种病原真菌具有极强的拮抗作用[7]; AA、CL菌是稗草生防潜力菌禾长蠕孢菌改良的优异特性的供体菌[8~10],同时也是开发真菌蛋白农药的原始菌种[11~13]。以啤酒、味精发酵废水和沼液为主要成分,添加少量其他元素开发成发酵培养基,一些特异的真菌、细菌和链霉菌能有效利用这些废水发酵培养基进行发酵培养,产生菌丝团或发酵代谢产物。TAS-1和HX-0501发酵原液及稀释10倍、50倍后,对多种病原真菌具有很好的抑制效果。
目前废水处理主要依靠机械、物理及化学的方法,处理成本高、不彻底。近年来,随着科学技术的进步,一些经济、高效、生态、可再生利用的生物处理废水的技术得到重视。在味精废水生物处理中,主要是利用味精废水研发发酵培养基,发酵培养苏云金芽孢杆菌生产生物农药[14~17]。本研究利用啤酒、味精废水和沼液为主要原料,成功开发出发酵培养基。试验证明我们分离、保存的AA、CL真菌, TAS-1放线菌和HX-0501细菌均能在上述工农业发酵废水培养基中进行发酵培养。TAS-1和HX-0501发酵培养后可产生代谢产物,生测结果表明, TAS-1和HX-0501代谢产物对水稻多个病原真菌和兰花病原菌具有较好的防效。现正优化废水培养基发酵培养TAS-1和HX-0501的工艺参数,以获得两菌的高发酵效价。利用废水开发发酵培养基,培养特定微生物生产生物农药目前已正申请国家发明专利[18]。是否可利用工农业废水大规模生产食用菌菌种[19]也值得进一步研究。