利用原生质体诱变筛选植酸酶高产菌株
2010-10-14 22:14:18   来源：本站原创   评论：0 点击：

李秀珍 薄 泉 杨平平 王 燕
摘 要 对产植酸酶的纯化黑曲霉用混合酶制取原生质体进行了研究。研究发现，经诱变后的原生质体在再生过程中菌落形态发生了明显变化，从中选育出了一株植酸酶的高产菌株，并对其遗传稳定性进行了鉴定。
关键词 植酸酶；黑曲霉；紫外诱变；原生质体
中图分类号 Q814
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要原料及试剂
植酸钠（由美国Sigma公司提供）、钼酸铵、冰醋酸、磷酸二氢钾、三水乙酸钠、偏钒酸铵、葡萄糖、氯化钾、硫酸镁、硫酸锰、硝酸等。
1.1.2 菌种
实验室保藏的黑曲霉2株、米曲霉1株。
1.1.3 培养基
斜面培养基：PDA培养基，自然pH值。
初始平板分离培养基：麦芽汁培养基（糖度为5.8），121 ℃灭菌20 min，自然pH值。
产酶培养基：100 ml培养基中含葡萄糖 3.0 g、NH4NO3 0.5 g、KCl 0.05 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、MnSO4·7H2O 0.03 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、植酸钙 0.01 g，121 ℃灭菌20 min，自然pH值。
再生平板培养基：100 ml培养基中含葡萄糖 4.0 g、NaNO3 0.3 g、KCl 0.05 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、FeSO4·7H2O 0.001 g、KH2PO4 0.01 g，用0.6 mol/l NaCl溶液配制，自然pH值，121 ℃灭菌20 min。
1.2 方法
1.2.1 菌种筛选
1.2.1.1 菌种初筛
将实验室保存的菌种运用稀释平板法分离，30 ℃培养3 d，选取单菌落（50株）接入斜面培养基，每种菌株斜面接入到1个三角瓶进行发酵，250 ml三角瓶装液量为50 ml，30 ℃、200 r/min摇瓶培养72 h，测定酶活。
1.2.1.2 菌种复筛
经初筛得到3～5株酶活较高的菌株，每种菌株斜面接入3个三角瓶进行平行发酵试验，250 ml三角瓶装液量为50 ml，30 ℃、200 r/min摇瓶培养72 h，测定酶活。
1.2.2 原生质体的制备
1.2.2.1 黑曲霉菌丝液的制备
将生长5 d的黑曲霉斜面孢子洗下，在6度麦芽汁中摇瓶培养8～12 h，收集菌丝体；菌丝用无菌水离心洗涤（5 000 r/min）2次，并用高渗液（0.6 mol/l NaCl）稀释适当倍数。
1.2.2.2 原生质体的制备
取菌丝悬浮液1 ml，加入1％的纤维素酶、1％的蜗牛酶溶液各0.5 ml，37 ℃水浴，振荡处理3～4 h，取样镜检，当有大量原生质体形成时停止酶处理，再用高渗液（0.6 mol/l NaCl）洗涤原生质体，500 r/min离心，即得原生质体。
1.2.3 原生质体紫外诱变及再生
原生质体用高渗液稀释至适当倍数，取10 ml放入无菌的Φ为9 cm平板内，30 W紫外灯，距平板30 cm处照射5、10、15 min后，红光下涂布于再生平板上，观察菌落生长情况。
1.2.4 植酸酶酶活的测定
以植酸钠为底物，采用钒钼酸铵法测定植酸酶的酶活。
将培养72 h的发酵液经4 000 r/min离心除去菌体,利用截流分子量为10 000 Da的透析袋在无离子水中将上清液透析2 h,得到去除无机磷的酶液。吸取1 mmol/l的植酸钠（酶作用底物，用0.25 mol/l、pH值5.50醋酸-醋酸钠缓冲液配制）1.0 ml,37 ℃预热5 min后，准确加入适当稀释的酶液0.5 ml（对照组先加反应终止液），37 ℃水浴反应30 min后，再加入4 ml反应终止液(现用现配) 冷却至室温，利用722型可见光分光光度计在415 nm处测定OD值，利用无机磷标准曲线计算出酶活。
酶活单位定义：在37 ℃，每分钟从1 mmol/l植酸钠溶液中（用pH值5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液配制）释放出1 nmol无机磷所需要的酶量为一个酶活单位(U)。
1.2.5 诱变菌株的遗传稳定性考察
对选出的有利诱变菌落进行传代接种摇床培养，测其酶活，初步考察其遗传稳定性。
2 结果与分析
2.1 出发菌株的选择
从实验室保存的2株黑曲霉、1株米曲霉中分别分离到50株单菌落，经过反复筛选得到3株酶活较高的菌株，其酶活情况见表1。

通过多次筛选和酶活大小的比较，黑曲霉1产酶量始终较高，所以选出黑曲霉1为原生质体诱变的出发菌株。
2.2 原生质体的制备
2.2.1 原生质体形态观察（见图1）

从图1中可以看出，供试菌株的原生质体和其它许多常见丝状真菌一样，可以从菌丝顶端和其它部位释放。在菌丝顶端和其它部位均同时出现菌丝膨大变形情况。这说明细胞壁已被水解掉，细胞膜凸出将要成为原生质体。原生质体释放时，通常是在菌丝的释放部位先膨大形成1个小球体，然后该球体逐渐增大，最后脱离菌丝，有的还可以在原有的释放部位紧接着又形成一个或几个原生质体。释放的原生质体多呈球形，大小不一。
2.2.2 菌龄对原生质体制备的影响
菌体的生理状态对原生质体的形成有很大的影响，用不同菌龄的菌丝制备原生质体的结果见图2。由图2可以看出，随着菌龄的增大，原生质体的产量逐渐减少，以菌龄为9 h时原生质体形成数较高。原因可能是菌龄增大后，菌体细胞老化和细胞壁上沉积较多的不易被酶解的物质，因而不易酶解，或者酶解后得到的原生质体活力不高，不能再生。

2.2.3 不同酶系统对原生质体制备的影响
由于真菌的细胞壁组成比较复杂，由外向内依次是不定形的葡聚糖层、糖蛋白层、蛋白质层、几丁质层。用不同的酶系统制备原生质体的结果见表2。

由表2可以看出，V纤维素酶：V蜗牛酶=3：7时，原生质体产量达到最高，为3.5×105个/ml。
2.2.4 酶作用时间对原生质体制备的影响
 酶作用时间不同对制备原生质体的影响见图3。由图3可以看出，2.5 h时原生质体形成数较高，2.5 h以后变化不大。但考虑到酶作用时间越长，细胞脱壁越完全,而原生质体的再生需要一定的细胞壁的酶解残余物作为引物。综合考虑，酶作用时间应该选取2.5 h。

2.3 菌种的诱变选育
2.3.1 诱变的时间（见表3）

表3结果可见，黑曲霉原生质体经过不同时间的诱变对致死率没有较大的影响，相对酶活也相差不大，因此，诱变时间确定为5 min。
2.3.2 诱变前后菌落形态特征
从菌体诱变前后来看，菌体的生长周期、菌落形态发生了一些变化，表现在：①诱变前后，菌落的生长周期发生了明显变化，原始菌种平板菌落生长期只需2～3 d长成，而诱变后的菌落生长期延迟到了4～5 d。②诱变后的黑曲霉平板菌落比原始菌平板菌落大且厚实。这说明，菌体制成原生质体后，加上紫外线对它的诱变作用，菌体基因确实受到影响，内在基因的变化导致菌体表观的改变，诱变效果比较明显。
2.3.3 高产菌株的选育
经过一轮诱变从中挑选出30株生长旺盛的菌落，接入摇瓶培养基，（30±1） ℃恒温培养72 h后测定酶活，进行初筛。从中挑选出3株酶活较高的菌株进行复筛，结果见表4。

通过多次筛选和酶活大小的比较，黑曲霉UV-1产酶量始终较高。
2.4 遗传稳定性试验
将经原生质体诱变筛选出的高产菌株黑曲霉UV-1连续传代5次，测其酶活，见表5。从表5中可以看出，黑曲霉UV-1的遗传性状基本稳定。

3 结论
本试验以实验室保存的2株黑曲霉和1株米曲霉为出发菌株，经过分离纯化筛选出1株酶活较高的黑曲霉1，采用原生质体紫外诱变处理能显著提高黑曲霉的植酸酶产量，酶活比出发菌株提高了10.35倍，其遗传性状基本稳定。
参考文献
1 Zyla K. Phytase application in poultry feeding：selected issues[J]. Journal of animal and feed science， 2001，10（2）：247～258
2 李佳，刘钟滨. 植酸酶的研究进展及应用[J]. 同济大学学报，2004， 25（6）:541～545
3 杨平平，许正宏，王燕，等. 植酸酶菌株筛选方法的研究[J]. 工业微生物，2004，34（3）：12～15
4 陈红歌，苗雪霞，张世敏.植酸酶高产菌株的诱变选育[J]. 微生物学通报，1997，24（3）：27～274
5 彭益强，贺淹才，全成恒. 用原生质体诱变选育高植酸酶酶活的黑曲霉变异株[J]. 微生物学，2002，22（5）：7～9
6 杨文博.微生物学实验[M]. 化学工业出版社， 2004. 104～104
7 朱萍，梁海秋，张弘，等. 黑曲霉Ni－5K原生质体的制备及再生[J]. 广西农业生物科学， 2005，24（4）：339～342
8 曹军卫. 黑曲霉原生质体的制备及再生[J]. 武汉大学学报（自然科学版）， 1984（4）：95～102
（编辑：高 雁，snowyan78@tom.com）
李秀珍，山东轻工业学院，250353，山东省济南市西部新城大学科技城。
薄泉，单位及通讯地址同第一作者。
杨平平、王燕(通讯作者)，浙江工业大学。
收稿日期：2007-02-20