枯草芽孢杆菌发酵豆粕产蛋白酶优化试验研究
2009-06-01 20:42:42   来源：本站原创   评论：0 点击：

卓林霞，吴晖，刘冬梅

豆粕是大豆提取豆油后的副产品，其中蛋白质质量分数高达43％以上。由于豆粕中缺乏水产动物必需的氨基酸，并含有胰蛋白酶抑制因子、植物血凝素和抗维生素等抗营养因子，限制了其应用。发酵豆粕是豆粕经过微生物发酵后的高蛋白饲料产品，微生物产生的各类消化酶类可有效地降解其中的抗营养因子和大分子营养物质。使豆粕更容易消化和吸收。枯草芽孢杆菌在适宜的条件下可产生多种酶类，使豆粕适口性更佳。

响应面法是数学方法和统计方法结合的工程优化方法，主要用于对生物产量受多个因素影响的问题进行建模和分析，其最终目的是优化该响应值，从而快速有效地确定最佳条件。近年来，响应面法在化工、生物、食品等领域也都得到了广泛应用。本研究的目的是以枯草芽孢杆菌为发酵剂，以枯草芽孢杆菌产蛋白酶活力为指标，应用响应面法对豆粕进行固态发酵优化试验的研究，以获得最优化的条件，进而提供更营养的发酵豆粕。

1材料与方法

1．1试验材料

1．1．1试剂

福林试剂(钨酸钠、钼酸钠、硫酸锂、液溴)、碳酸钠、三氯乙酸(TCA)、甲醛、氢氧化钠、乙醇等，均为分析纯；干酪素、酪氨酸、低分子质量(24～97 ku)标准蛋白和其它电泳试剂均为生化试剂(北京某生物技术有限责任公司)。

1．1．2  原料

低温豆粕。

1．1．3菌株及培养基

菌株：本实验室筛选并保藏枯草芽孢杆菌(Bacillus Sub—tills)；斜面培养基：牛肉膏3g/L，蛋白胨10 g／L，NaCl 5 g／L，琼脂2 g／L，pH 7．0；种子培养基：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH 7．0。

1．1．4设备

DYY一6C型电泳仪及电泳槽，可见分光光度计22PC，HH型电热恒温水浴锅，PQX型多段可控人工气候箱，超净工作台，真空冷冻干燥机，高效液相色谱仪，自动凯氏定氮仪，高压灭菌锅，恒温摇床机，磁力搅拌器等。

1．2试验方法

1．2．1试验流程

菌种活化一种子培养基一接种

豆粕一预处理一121℃灭菌20 min一培养基一固态发酵一冷冻干燥一粉碎一加水浸提一离心一上清液

1．2．2菌种活化及种子扩大培养

配制营养肉汤种子培养基，将50 ml营养肉汤装于250 ml三角瓶中，包扎封口后，于l21 °C、0．1 MPa条件下灭菌20 min；冷却后接入斜面培养24 h的枯草芽孢杆菌一环，在转速200 r／min、温度(30±1)°C条件下摇瓶培养20 h。

1．2．3豆粕固态发酵培养

500 ml三角瓶中加入豆粕50．00 g、水50 ml，在pH7．0、121℃条件下灭菌20 min，冷却至室温接入20 h种龄的适量种子液，于不同发酵条件下培养发酵。发酵结束后将发酵产物冷冻干燥，研碎过筛，备用。

1．2．4发酵水提液的制备

称取过80目的发酵豆粕5．000 g，加入蒸馏水定容至100 ml，在40°C、100 r／min下水浴浸提1 h，4 000 r／min离心20 min，取上清液待测。

1．2．5响应面法分析

通过感官分析、蛋白酶活力研究对豆粕的料水比、发酵温度，培养时问、接种量和初始pH值对枯草芽孢杆菌生长产蛋白酶的影响后，以蛋白酶活力值(U／ml)为响应面值，通过SAS试验确定豆粕固态发酵的最优条件。

1．3豆粕及发酵豆粕各成分的测定

1．3．1粗蛋白质含量的测定

参照GB／T 5009．5—2003。

1．3．2蛋白酶活力的测定  

用福林法测定。5 J。本试验酶活力定义为在400C、pH7．2条件下，l ml发酵水提液(粗酶液)、1 min水解酪蛋白产生1ug酪氨酸为l个蛋白酶活力单位(U)，单位为“U／ml”。“U／ml”转换成“U／g”单位时需除以样品干物质的含量，表示为每1 g发酵豆粕中的蛋白酶活力(以下表述同)。

具体操作步骤及标准曲线参考文献。计算公式如下：

式中，△A为样品测定与空白试验光密度之差；K为A6为l时在标准曲线上对应的酪氨酸浓度，取K=95；Ⅳ为粗酶液的稀释倍数；4为反应试剂总体积，ml；10为反应时间，min。

1．3．3氨基态氮测定

用甲醛滴定法测定，计算公式如下：

式中，Ⅵ为稀释液在加入甲醛后滴定至ph9．2所用NaOH标准溶液的体积，ml；V为空白滴定在加入甲醛后滴定至pH9．2所用NaOH标准溶液的体积，ml；C为NaOH标准溶液的浓度，mol／L；M为称取的豆粕或发酵豆粕的质量，g；0．014为氮的毫摩尔质量，g／mol。

1．3．4水解度的测定

甲醛滴定法测定氨基态氮含量，氮含量采用微量凯氏定氮法，水解度(DH)计算公式如下：

式中，“一NH₂含量”为氨基态氮的含量，μmol／ml；N为样品中氮的含量，g／ml；6．25为氮的转化系数；0．33为豆粕中游离的氨态氮含量，umol／g；7．8为豆粕完全水解后氨基态氮含量，umol／g。

1．3．5菌落计数法

取1．000 g发酵豆粕接种于10 ml的无菌生理盐水中，并吸取1．00 ml依次按梯度稀释进行平板计数，重复3次。

1．3．6氨基酸分析

取1．2．3各样品的上清液进行测定豆粕与发酵豆粕中游离氨基酸(FAA)含量。分析柱为PIC0．TAG氨基酸分析柱；温度为38％；检测波长为254 nm；流速为l．00 ml／min；进样量：10ul。

1 3．7  十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电冰(SDS—PAGE

(1)大豆蛋白的提取(根据文献方法，略有改动)

取已冻干、过80目的豆粕粉和发酵72 h的发酵豆粕，用乙醚(豆粉与乙醚的体积比为l：6)脱脂3次，脱脂豆粉用10倍体积的蒸馏水分散(搅拌)完全，之后用2 mol／L NaOH调节至pH8．0，室温下搅拌2 h后离心(9 000 r／min，30 min)。离心所得的上清液经2 mol／L HCl调节至pH4．6，于4℃下放置2 h，之后离心。所得沉淀物用蒸馏水洗3次，用蒸馏水重新分散，并调节至中性。该分散液经透析24 h后冷冻干燥，即得大豆分离蛋白。

(2)样品处理(蛋白质标准品按说明书处理)

在不连续缓冲系统上，分离胶和浓缩胶质量分数分别为7．2％和4％。准确称取(4．0±0．1)mg样品和移取1．00 ml样品缓冲液(3．2 ml pH6．8、50 mmol／L Tris—HCl、11．5 m110％SDS溶液、2．5 ml 13-巯基乙醇、溴酚蓝2 mg以及甘油5 ml，定容至50 ml)于1．50 ml离心管中充分混匀，100℃水浴5 min，取出冷却后于SDS—PAGE样品槽中均匀注入16．00ul的样品液。

(3)电泳条件

采取恒流。电流先取l0 mA，待进入分离胶后改为25 mA，电泳2．5 h。电泳结束后，剥胶、染色、脱色及拍照保存。染色采用考马斯亮蓝R-250。

2结果与分析

2．1响应曲面法分析因素的选取及分析

通过对发酵温度、发酵时间、初始pH值、接种量、料水比等因素的不同水平，综合单因素试验结果，试验固定装料量为50 g／500 ml锥形瓶、发酵温度为30°C、发酵时间为72 h。选取初始pH值、接种量、料水比三个影响因素，采用响应面分析方法确定最佳发酵工艺条件。根据中心组合Box—Be—hnken设计原理，设计了3因素3水平共l5个试验点的响应面分析试验，以蛋白酶活力为响应面值，在中心点重复3次，试验设计及结果如表1、表2。

通过SAS的响应面回归过程进行数据分析，建立了二次响应面回归模型，并进而寻求最优响应因子水平。

SAS分析对蛋白酶活力所得到的拟合全变量二次回归方程变量，经回归拟合后，得到二次回归方程为：

Y=29．906 0-5．449 9X1一0．768 0X2—0．042 9X3—6．328 0X1 2 9．324 7X2 2—5．148 0X3 2+1．630 8X1X2一1．273 0X1X3+0．632 3X2X3

由表3可知，模型大于F的概率为0．000 1，说明此模型的可信度较高，可以选择(可信度≥95％)；其中R2=0．995 2，说明回归拟合程度好。

对回归方程求一阶偏导数，当响应值蛋白酶活力(Y)有最大值时可求得各因素的水平：x1=一0．445 8，X=一0．078 5，X=0．046 4，对应最大值Y=31．1 U／ml，即为622 U／g，所得3因素的最佳水平为pH6．6、接种量为3．8％、料水比为l：1。响应面图及等值面图分别见图l和图2。

为了确定建立的模型与试验结果是否相符，根据以上试验结果确定主要影响因素来配制与培养发酵培养基。进行3组平行试验，得到枯草芽孢杆菌固态发酵豆粕产蛋白酶活力均值为32．4 U／ml，即为648 U／g(见表4)，与模型最大值31．1 U／ml(622 U／g)接近。说明用响应面法寻求最优的发酵豆粕蛋白酶优化培养基是可行的，枯草芽孢杆菌蛋白酶可有效降解发酵豆粕中的大豆蛋白，形成更多的游离氨基酸等小分子物质，更易消化和吸收，为替代鱼粉提供更有营养的成分。

2．2最优条件下发酵豆粕营养成分

为研究最优条件下豆粕发酵前后的成分变化，试验用最优条件下制备发酵豆粕以测定其它成分，结果见表4。

由表4可知，发酵前后粗蛋白质含量提高了近4个百分点，可能是引入的枯草芽孢杆菌的菌体蛋白使其值升高，这与文献报道的一致；由于枯草芽孢杆菌产生的蛋白酶可降解蛋白质，可能原因是产生的蛋白酶将大分子蛋白质分解成更小的物质，如肽、氨基酸等。因此氨基态和水解度有所提高，其中水解度为l4．57％，高于文献报道的优化发酵豆粕水解度(13．02％)的研究。

从表5可以看出，豆粕与发酵豆粕水提液中均含l7种氨基酸成分(即天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、胱氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸)，测定游离氨基酸含量为161．22 mg(100 ml)，是初始游离氨基酸总量的3．55倍，且发酵豆粕中各氨基酸成分较豆粕都有不同程度的增加；其中豆粕中的半胱氨酸、丙氨酸含量均较少，分别为0．01、0．22 mg／(100 ml)，而精氨酸较多；发酵豆粕中较少含量的游离氨基酸为半胱氨酸，含量为0．52 mg／(100 ml)；除色氨酸因为经过酸性水解破坏而检测不出外，豆粕与发酵豆粕其余7科必需氨基酸之和所占比率分别为l7．76％和33．01％。

2．3蛋白质降解

为了研究经发酵后豆粕中蛋白质的变化，进行了发酵前后豆粕的SDS—PAGE电泳分析，结果见图3。

从图3可以看出：未发酵前，豆粕中的主要蛋白质亚基分子可以很明显地分离出来，大豆蛋白主要由大豆球蛋白(Glycinin)和B一伴大豆球蛋白(3-conglycinin)组成，大豆球蛋白又由不同的酸性亚基(A1～4)和碱性亚基(B)组成，其分子量分别为37．6和19．8 ku，而β一伴大豆球蛋白主要由及β一亚基组成，分子量分别为90．5、71．5和55．2 ku。而经过发酵的豆粕，其中的大分子蛋白质可有效地被降解，大分子蛋白质基本上降解成小分子的蛋白质，分子量主要集中在36 ku以下。这与文献等研究有类似的结果。

3结论

采用Box—Behnken设计和minitabl5软件进行分析，得到发酵产蛋白酶最佳培养基配方为：pH6．6，接种量3．8％，料水比l：1。这与回归方程取得的值很接近，说明模型是比较可靠的。因此用响应面法寻求最优的发酵豆粕蛋白酶优化培养基是可行的。

发酵后游离氨基酸含量是发酵前的3．55倍，通过SDS—PAGE电泳图的分析，优化后的发酵豆粕可有效地降解豆粕中的大分子蛋白质，形成各类小分子营养物质，主要集中在36 ku以下的小分子物质。说明枯草芽孢杆菌固态发酵豆粕可潜在地提高饲料蛋白的营养水平。

摘自《粮食与饲料工业》.-2009，(2).-32~35