植物丙酮酸脱氢酶系及其调节酶的研究进展
2007-12-18 23:45:36   来源：食品与发酵工业   评论：0 点击：

摘要：糖类需氧氧化过程的限速步骤是丙酮酸的脱羧氧化，催化此反应的酶是丙酮酸脱氢酶系（pyruvate dehydrogenase complex，PDC）。PDC存在于线粒体中，其核心结构由三种酶组成。丙酮酸脱氢酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinase，PDK），是PDC的负调控酶，负责催化丙酮酸脱氢酶（Pyruvate dehydrogenase，PDH）磷酸化使其失活。丙酮酸脱氢酶磷酸酶（Pyruvate dehydrogenase phosphatase，PDP）则催化已磷酸化的PDH去磷酸化使其复活。本文主要从酶的结构及作用机制方面作简单概述。

关键词：丙酮酸脱氢酶系；丙酮酸脱氢酶激酶；丙酮酸脱氢酶磷酸酶 

作者简介：谭才邓（1980-），汉，广东台山人，助教，在职攻读硕士研究生，研究方向:植物基因工程。

 糖的需氧氧化反应可分三个阶段进行。第一阶段是通过糖酵解产生丙酮酸；第二阶段是丙酮酸氧化脱羧形成乙酰CoA；第三阶段是乙酰CoA进入三羧酸循环，产生大量的能量供机体生长发育。其中催化第二阶段反应的酶是丙酮酸脱氢酶系（PDC），由于反应的不可逆性，PDC在新陈代谢调节中起着极其重要的作用。在原核生物中，PDC存在于细胞质中，在真核细胞中主要定位在线粒体上，高等植物细胞比较独特，拥有两种截然不同、空间上被分开的PDC形式，一种是线粒体PDC(mitochondrial PDC,mtPDC)，另一种是定位在质体基质中的质体PDC（plastid PDC,plPDC）。mtPDC催化反应生成的乙酰CoA进入三羧酸循环彻底氧化产生能量，而plPDC催化反应生成的乙酰CoA则进入脂肪酸合成途径。虽然两种PDC的活性都受到反应底物和产物浓度的影响，但只有mtPDC的活性是通过磷酸化/去磷酸化机制进行调节。丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）是PDC的负调控酶，它催化PDH的α亚基磷酸化，磷酸化的PDH不能催化丙酮酸氧化脱羧反应，从而导致糖酵解形成的丙酮酸不能进入三羧酸循环。丙酮酸脱氢酶磷酸酶（PDP）则将磷酸化的PDH去磷酸化使PDH恢复活性。PDK与PDP同时有活性，并且两个反应都是多点可逆的，两者之间的对抗共同决定了稳定状态的PDC活性^[2]。近年研究发现，哺乳动物中有4种PDK同工酶，植物有1～2种PDK同工酶，分别在生长发育的不同阶段、不同组织中表达。

1.丙酮酸脱氢酶系（PDC）

1.1丙酮酸脱氢酶系的组成与结构

丙酮酸脱氢酶系的核心结构是由丙酮酸脱氢酶(PDH,简称E1，EC 1.2.4.1)、二氢硫辛酸乙酰转移酶(dihydrolipoamide acetyltransferase , 简称E2 ,EC 2.3.1.12)和二氢硫辛酸脱氢酶 (dihydrolipoamide dehydrogenase ,简称E3 ,EC 1.8.1.4) 组成。这三种酶在PDC的催化反应过程中以首尾相接的形式发挥作用，这种结构上的有序结合使丙酮酸脱氢酶系催化形成乙酰CoA的复杂反应得以顺利进行，而且可以避免不必要的副反应。与低等生物不同的是，高等生物体内的PDC还包括另外3种蛋白质，即：丙酮酸脱氢酶激酶（PDK，EC 2.7.1.99）、丙酮酸脱氢酶磷酸酶（PDP，EC 3.1.3.43）和E3结合蛋白（E3-binding proein,E3Bp）。另外,在丙酮酸脱氢酶系起催化作用的过程中还有另外6 种重要的辅助因子参与，它们是TPP、Mg²⁺、硫辛酸、FAD、NAD⁺、CoASH。

图1  A：原核PDC的E2六面体结构核心框架图； B：真核PDC的E2十二面体结构核心框架图； C：E1三体结合上E2结构核心框架图； D：PDC的E1全部结合上E2结构核心框架图。

图2  PDC的E2亚单位结构域图。①大肠杆菌的E2单体结构域；②人的E2单体结构域；③啤酒酵母的E2单体结构域。L --- N端疏水结构域；B --- E1与E3的结合部位；C --- C端催化活性部位。 

1.2丙酮酸脱氢酶系催化的反应机制

目前PDC的功能及作用机理已经研究得比较清楚,其催化丙酮酸氧化脱羧反应的方程式可总结为：丙酮酸+NAD⁺+CoA-SH→乙酰CoA+ CO₂ + NADH+ H⁺。PDC的三种主要成份酶在催化反应过程中以首尾相接的形式发挥作用，首先E1与其辅助因子TPP在α,β亚单位之间的深沟内结合，在Mg²⁺存在的情况下催化丙酮酸脱羧，形成羟乙基-TPP；然后,羟乙基被移到E2并氧化成乙酰基，乙酰基再与结合上E2的硫辛酸结合形成乙酰硫辛酰胺，接着E2催化乙酰硫辛酰胺上的乙酰基转移给CoA-SH形成乙酰CoA；E3则负责把还原型的硫辛酸氧化形成氧化型的硫辛酸，并把氢传递给FAD，FADH₂再使NAD⁺还原，形成循环（图3）。其中E1是PDC的限速酶。

2.丙酮酸脱氢酶系的调节酶

2.1丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）

目前对PDK基因的研究大都集中在动物细胞上，动物细胞具有4种形式的PDK，在不同的代谢条件下特异调控PDC。对植物PDK的研究是基于动物PDK的研究进展，目前已在拟南芥、玉米、水稻等植物进行研究，已发现植物有1～2种形式的PDK，其中对拟南芥PDK的研究较多。PDK的同工酶当中，对PDK2的研究比较多，PDK2可分为两部分：N端不保守区域和C端保守区域，催化活性部位在C端（图4-A）。N端部分主要由α螺旋组成；C端部分有既α螺旋又有β折叠，多个β折叠排列构成一个大折叠面，N端部分与C端部分通过α螺旋连接起来。PDK通常以二聚体形式存在，两个单体通过C端的大折叠面相互作用靠在一起，N端朝外，形成有一个中心和两个臂的结构（图4-B）。N端与C端间有一大沟，其大小与形状刚好与PDC的E2亚基N端疏水结构域相吻合，PDK二聚体拥有两个大沟，方向背对朝外，在PDC表面迅速翻移以寻找E2的疏水结构域，当结合上E2亚基上的疏水结构域时，有助于促使二聚体中心部位的暴露而与E1相结合，催化E1磷酸化，阻断丙酮酸到乙酰CoA反应的进行^[1]。

图4：   A：PDK单体的二级结构图。 B：PDK二聚体图，青色部分代表α螺旋，黄色部分代表β折叠。

Thelen等^[2]对玉米PDK进行了研究，其氨基酸序列大约有37%与哺乳动物的相似，同源性氨基酸残基集中在11个高度保守的不连续区域，其中有5个与原核组氨酸激酶相似，从而称PDK为类组氨酸激酶。在与组氨酸激酶高度相似的5个保守结构域中，一处位于N端，四处位于C端，分别称为：H-box，N-box，D-box ，G1-box和G2-box（图5），其中G1-box和G2-box间的α螺旋主要是疏水性氨基酸，ATP极易与这些分子相结合；N-box是磷酸基团结合部位。当ATP结合在C端的疏水氨基酸基团上时，N-box的磷酸接受基团直接攻击ATP上的γ磷酸基团，使ATP变成ADP，而自身带上磷酸基团^[9]。

图5：  玉米两个PDK同工酶的保守结构域图。罗马编号Ⅰ～Ⅴ的五个结构域是与原核组氨酸激酶相似的结构域，分别对应H-box、N-box、D-box、G1-box和G2-box；英文编号A～F是真核PDK中特有的六个保守结构域；带星号的氨基酸残基是高度保守的氨基酸残基。

PDK一个明显的调节机制是底物蛋白E1的α亚基三个丝氨酸残基磷酸化，所以PDK是丝氨酸激酶。丝氨酸激酶的活性部位有12个保守的结构域，互相联系形成一个活性催化中心。通过序列分析，PDK缺少上述丝氨酸激酶所要具备的结构域，而拥有5个与细菌组氨酸激酶相似的结构域(H-box,N-box ，D-box ，G1-box和G2-box)。研究表明，哺乳动物、植物、果蝇、线虫等拥有相同的结构^[2,3]。在催化反应中，组氨酸激酶先自身磷酸化，磷酸基团受体是位于N端的组氨酸残基，然后再将磷酸基团转移到底物蛋白的天冬氨酸残基或谷氨酸残基。PDK的催化机理与组氨酸激酶的催化机理相似，在催化反应中，有多处组氨酸残基参与转移磷酸基团，但其催化底物的磷酸接受基团是丝氨酸残基^[1-5]。与E2的结合能提高PDK的酶活，用游离的PDK催化游离的E1的磷酸化反应速度要比PDC复合体状态的E1的磷酸化速度低10倍。这是由于PDK通过大沟紧密结合在PDC复合体E2亚基N端的疏水结构域上，结合上E2的PDK其催化中心充分暴露，从而使激酶活性增强^[1,6]。

2.2丙酮酸脱氢酶磷酸酶（PDP）

PDP是定位于线粒体上的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，负责催化已磷酸化的PDH去磷酸化从而使PDH恢复活性。PDP的催化机制在许多地方与PDK有着相似之处，它与E2的结合不如PDK那样紧密，但仍然比游离的PDP去磷酸化速度提高约10倍。PDP与E2的结合部位也是E2的N端的疏水结构域，其活性的发挥需要硫辛酰基以及二价阳离子的参与^[2,5,8]。目前对植物PDP的研究少见报道。

3、PDK在分子生物学上的研究进展

由于PDC催化的反应不可逆， PDK作为PDC的负调控酶，在新陈代谢调节中起着极其重要的作用。有关PDK的研究大多集中在动物中，如哺乳动物。近年来在植物中的研究陆续进行，主要集中在拟南芥和玉米，在水稻中的研究近两年才见有报道。近年研究发现，哺乳动物有4种PDK同工酶，玉米、水稻等有2种PDK同工酶，拟南芥有1种PDK。

基于哺乳动物PDK的研究，现已克隆到多种植物的编码PDK的cDNA。Thelen等^[2]从玉米中克隆到两个PDK同工酶基因。PDK1与PDK2有77%的氨基酸相似性；玉米PDK与拟南芥PDK约有70%的氨基酸相似性；玉米PDK与哺乳动物PDK约有37%的氨基酸相似性。通过序列分析，玉米PDK含有11个高度保守的结构域。通过RT-PCR反应发现，PDK1与PDK2的表达模式不一样，PDK1在生长发育的整个过程保持大量表达，而PDK2只在绿叶中有较高的表达量，在其它部位微量表达或不表达，可能是绿叶在光合作用时合成大量的ATP刺激PDK2的表达。

利用反义技术部分抑制拟南芥PDK的表达，其结果是PDK的表达量下降，PDC活性增加，同时转基因植物改变其生长表形：植物生长产率提高了，种子重量及含油量增加，营养器官的养分积累减少、花期提前、生活周期缩短等，并且，实验数据表明，在未成熟的种子中，mtPDC与脂肪酸的合成有关。通过免疫印迹，利用拟南芥PDH的α亚基的单基隆抗体作探针，Zou等^[4]得到的结果是反义抑制PDK表达的转基因拟南芥其PDH的α亚基的表达量并没有比野生型的高，认为PDC活性的增强并不是PDH蛋白表达量的增加，而是取决于其活性调节酶PDK的表达水平。李静、Jan等^[7]研究发现水稻有两个PDK基因：两者的核酸序列相似性为82%，氨基酸序列相似性为83%。研究表明两个PDK基因具有不同的生物学功能。PDK1在叶部表达量较高，PDK2在各个器官都有较高的表达量。构建反义表达载体部分抑制PDK基因的表达，得到以下结果：反义PDK1后代性状变化主要发生在叶片,表现为分蘖减少、叶色变浅、发育迟缓以及生育期处长；反义PDK2后代性状变化主要发生在穗部,表现为抽穗期提前、花粉育性下降、结实率下降、株高变低以及生育期缩短。另外，GA能上调PDK1的表达，从而下调PDC的活性，而其它激素（2,4-D，BA，BL等）对PDK1的表达基本无影响^[7]。

4、结语

在近20多年的研究中，对PDC、PDK的研究有了很大的进展。但是植物细胞PDC的很多方面都还没有揭示清楚，例如PDC的天然结构和特性还不是很清楚，PDH的活性范围波动很大，其自然变异程度也很高。目前掌握的植物PDK的信息还比较少，譬如动物细胞具有4种形式的PDK，而植物细胞中只有一到两种，那么植物中的PDK 又是怎样起充分调控PDC活性作用的呢？对植物PDP结构方面的认识几乎一片空白。总之，这些问题还有待人们进一步深入的探讨。