一株假单胞菌对联苯以及苯甲酸的降解
2007-12-18 23:51:19   来源：食品与发酵工业   评论：0 点击：

　　【摘 要】 利用贫瘠培养基从某化工厂污染的土壤中分离到一株能够利用联苯为唯一碳源和能源生长的假单胞菌M21-1，进一步分析发现菌株能够降解联苯为苯甲酸，而且也能够利用苯甲酸生长，从而说明M21-1能够彻底矿化联苯，显示出菌株在降解环境污染物方面具有很大优势。
　　【关键词】   联苯，苯甲酸，假单胞菌

前言

　　多氯联苯(polychlorinated biphenyls, PCBs)是联苯1-10位的氢原子被氯原子取代后形成的一系列化合物，其同分异构体和同系物有209种。 由于其具有良好的化学稳定性、热力学稳定性和绝缘性, 曾被广泛用作变压器和电容器内的绝缘介质,并在多种行业中用作增塑剂，交换剂和阻燃剂。由于多氯联苯具有持久性、生物蓄积性、长距离大气传输性等，可以在环境以及动物体内长时间存在。多氯联苯具有致癌性，神经毒性以及内分泌干扰作用，为《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》最先规定在全球范围内消除的12种有毒污染物之一[1，2]。

　　传统的持久性有机污染物（POPs，包括多氯联苯）处理技术，如填埋、回收、高温处理、焚烧等费用高，而且容易产生有毒中间物，造成二次污染。近年来，微生物在降解环境有毒物，净化生态系统方面的作用越来越引起人们的注意，研究微生物对多氯联苯的降解，利用微生物修复被多氯联苯污染的环境具有重要的理论意义和应用价值。多氯联苯的微生物代谢分为上游途径和下游途径，经过上游途径的代谢，多氯联苯被降解为氯代苯甲酸，氯代苯甲酸同样为环境污染物，因此，对多氯联苯的彻底矿化需要微生物同样具有降解氯代苯甲酸的能力。通常情况下，多氯联苯降解基因和氯代苯甲酸降解基因位于细菌不同的基因操纵子上，多氯联苯的彻底降解需要相关基因的共同表达，而且具有多氯联苯降解能力的菌株不一定具有氯代苯甲酸降解能力[3]。共代谢在多氯联苯的降解过程中起重要作用，这种菌株的筛选一般以联苯为唯一碳源富集得到，筛选到的菌株用联苯培养后可以高效降解多氯联苯[4]。

　　本课题以联苯为唯一碳源，利用贫瘠培养基从化工厂污染的土壤中筛选到一株联苯降解菌，初步鉴定为假单胞菌M21-1；另外，菌株具有降解氯代苯甲酸母环化合物苯甲酸的能力，因此在环境修复中可能会起重要作用。

1　实验所用材料和方法

1.1实验仪器

　　气相色谱-质谱连用仪（GC-MS）；液相色谱仪（HPLC，4.6×150mm ，ZORBAX SB-C18）

1.2实验药品和实际试剂

　　贫瘠培养基：1 L水中加入KH2PO4：2 g，K2HPO4·3H2O：3 g，(NH4)2SO4：1 g， NaCl：1.5 g，MgSO4：0.3 g，CaCl2：0.1 g，调pH为7.0。在121度高温灭菌15分钟。

　　试剂：联苯；氯仿；盐酸。

　　筛菌用土壤，采自青岛红星化工厂附近的污染土壤。

1.3实验方法

1.3.1菌株筛选和鉴定

　　利用一升的摇瓶，加入150ml贫瘠培养基，加入1 g/L的联苯，加入5 g污染土壤，在28℃摇床上培养，转速为180 rpm/min，培养三天后取出15ml培养液转到新的培养基中，同样加入1 g/L的联苯，反复转接10次之后取出100 ul适当稀释后涂布于含1.5%琼脂和联苯的贫瘠培养基平板上，于28℃培养箱中培养，两天后挑选菌落。挑取一个生长迅速的单菌落根据《伯杰手册》进行菌株鉴定，鉴定其为假单胞菌M21-1，并利用其进行下一步的实验。

1.3.2菌株代谢联苯中间产物分析

　　利用生长体系，加入1 g/L的联苯培养细菌，分别在细菌生长1天，2天，3天后取样，合并样品，离心除掉菌体，利用2mol/L浓度的盐酸将上清液酸化至pH值为2，利用四分之一体积的氯仿萃取三次，合并萃取液，将萃取液浓缩后利用GC-MS分析。

1.3.3菌株降解联苯和苯甲酸实验

　　以联苯或苯甲酸作为唯一碳源，培养基配方同前，接种量10%（v/v），空白对照有两种：一种为加菌不加底物，另一种为细菌灭活后加底物。取样时间为（小时）0，5，15，27，40，55，72。每个样品平行三份。菌株降解联苯样品的细菌浓度测定方法为：过滤除掉未利用完的联苯，然后利用分光光度计测量过滤液在600纳米波长处的吸光值；菌株降解联苯样品的底物浓度测定方法为：由于联苯不溶于水，所以利用氯仿整瓶萃取反应液，然后利用HPLC对萃取液中的联苯含量进行测定。菌株降解苯甲酸样品可以直接利用分光光度计测菌浓度，样品取样后除掉细菌和蛋白后直接用HPLC测苯甲酸浓度。

2 　实验结果

2.1菌株的鉴定

　　利用贫瘠培养基，从红星化工厂污染的土壤中筛选出一株联苯降解菌M21-1。菌株的鉴定根据《伯杰手册》进行。菌株为革兰氏阴性，短杆状，好氧；氧化酶，过氧化氢酶反应为阳性，具有反硝化作用；精氨酸水解，明胶水解，淀粉水解，脂水解反应都为阴性。根据上面的信息还有碳源利用情况初步鉴定菌株为假单胞菌。

2.2菌株代谢联苯中间产物分析

　　利用GC-MS分析菌株利用联苯生长的反应液，有一个很明显的产物峰出现，鉴定为苯甲酸，结果如图1所示

2.3菌株利用联苯和苯甲酸生长结果

　　分别以联苯和苯甲酸为唯一碳源培养细菌，结果显示，联苯在15个小时内被完全降解，苯甲酸在40个小时内被完全降解，如图2所示。可见，假单胞菌M21-1对联苯以及其代谢产物苯甲酸都具有较强的降解能力，但是对苯甲酸的降解能力稍微差一些。
 3 　结论

　　大量的研究证明，能够降解联苯的菌株通常能够共代谢降解环境有毒物多氯联苯[4]。人们在研究微生物降解多氯联苯过程中经常会遇到中间代谢物氯代苯甲酸积累的问题，氯代苯甲酸的产生会造成环境的二次污染，所以利用其母体化合物苯甲酸筛选到的菌株也会在彻底降解多氯联苯过程中起到积极作用。假单胞菌M21-1能够同时代谢多氯联苯和多氯代苯甲酸母体化合物联苯和苯甲酸，因此必将在环境修复中起到重要的作用。

参考文献
[1]高军，骆永明．多氯联苯(PCBs)污染土壤生物修复的研究进展[J]．安徽农业科学．2005，33:2119-2121．
[2]聂湘平．多氯联苯的环境毒理研究动态[J]．生态科学．2003，22:171-176．
[3] Kitagawa, W., Miyauchi, K., Masai, E., Fukuda, M.. Cloning and Characterization of Benzoate Catabolic Genes in the Gram-Positive Polychlorinated Biphenyl Degrader Rhodococcus sp. Strain RHA1. J. Bacteriol. 2001，183:6598-6606.
[4]李霜，李朝林，吴维皑．多氯联苯与人体健康[J]．中国劳动卫生职业病杂志．2005，23：316-319．

【作者简介】白卯娟，1977年10月，女，讲师    研究方向：环境生物治理。
baimaojuan@sina.com