β-甘露聚糖酶产生菌的筛选和酶学性质研究
2007-12-18 23:34:38   来源：食品与发酵工业   评论：0 点击：

摘  要：从土壤中分离筛选出5株产胞外β-甘露聚糖酶的菌株，其中DK3菌株的摇瓶培养液的酶活力达3.85 U /ml。该酶水解葡甘露聚糖的最适温度为37℃，最适pH为6.0，pH稳定范围为5.0~9.0 ，在低于40℃的温度下基本稳定。Fe ²⁺ 、Cu²⁺、EDTA和NH₄⁺ 对该酶有抑制作用，Na⁺ 则有激活作用。 

关键词： β-甘露聚糖酶；筛选；酶学性质  

β-1,4-D-甘露聚糖酶(β-1,4-D-mannan mannanohydrolase，EC.3.2. l. 78)是一类能水解含有β-1,4-D-甘露糖为主链的多糖(包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘聚糖等)的内切酶^[1]。该酶用途广泛，能分解魔芋葡甘露聚糖，生产能促进双歧杆菌生长、改善肠道菌群结构的魔芋低聚糖；可作为工具酶用于天然多糖类结构的分析；在造纸工业中，与β-木聚糖酶等半纤维素降解酶类协同使用，能除去纸浆中的半纤维素，改善纸质；在纺织工业中用于纤维中半纤维素的降解，能有效去除纺织品所粘附的多余染料；在饲料工业中用作酶添加剂，起到消除抗营养因子的作用^[2-4]。虽然β-甘露聚糖酶的应用前景广阔，但目前总的来说，其低产和高成本限制了其应用范围和规模，能改变这种状况的最重要的途径之一是筛选和培育产高活力β-甘露聚糖酶的高产菌株。

1  材料与方法

1.1 土壤来源    

土壤样品从广西大学农场甘蔗地、广西南丹县魔芋种植地和南宁绿源肥料厂堆肥地采集。

1.2  试剂

葡甘露聚糖（商品名：魔芋精粉）购自武汉市清江魔芋制品有限公司。

其它试剂均为分析纯试剂。

1.3  培养基

富集培养基（%）：魔芋精粉2.0，酵母膏0.5，蛋白胨0.3，NaCl 0.5；

固体分离培养基（%）：魔芋精粉1.0，NaNO₃ 0.3，MgSO₄·7H₂O 0.5，KCl 0.5， K₂HPO₄ 0.1，FeSO₄·7H₂O 0.001，琼脂 1.0，pH6.0；

发酵培养基（%）：魔芋精粉1.0，酵母膏0.5，蛋白胨0.3，NaNO₃ 0.3，MgSO₄·7H₂O 0.5，KCl 0.5，K₂HPO₄ 0.1，FeSO₄·7H₂O 0.001，pH6.0；

产酶培养基（%）：魔芋精粉1.0，NaNO₃ 0.3，MgSO₄·7H₂O 0.5，KCl 0.5，K₂HPO₄ 0.1，FeSO₄·7H₂O 0.001，pH6.0。

1.4  菌株的分离和筛选

称取1 g土壤于试管中，加入l0ml蒸馏水，振荡混匀，取l ml接种到富集培养基中，37℃，160 rpm培养24 h。选择培养液粘度明显下降的菌液，用无菌水梯度稀释后涂布于固体分离培养基中，置 37℃培养箱中培养24 h，用刚果红染色，观察菌落周围有无透明圈，挑取透明圈大的单菌落进行划线纯化。经纯化后的菌株在发酵培养基中培养24 h，测定培养液中β-甘露聚糖酶的活力，筛选出酶活力高的菌株。

1.5  β-甘露聚糖酶粗酶液的制备

将菌株接种于发酵培养基中，37℃培养24 h，按l %比例接入产酶培养基中，37℃，160 rpm培养24 h。发酵液离心所得上清液即为粗酶液。

1.2.4 β-甘露聚糖酶酶活力的测定

酶活力的测定：取0.4 ml  0.5%(w/v)葡甘露聚糖 (用pH7.0，0.01 mol/L 磷酸钠缓冲液配制)，加入0.1 ml 适当浓度的酶液，37℃水浴反应15 min，用DNS法测定所产生的还原糖^[7]。

酶活力单位定义：在上述反应条件下，每分钟由底物释放出相当于1µmolD-甘露糖的还原糖所需酶量为1个酶活力单位(U)。

2  结果

2.1  菌株筛选

从土样中筛选出5株产β-甘露聚糖酶的高产菌株（编号为DK1~5）,其中DK3菌株的摇瓶培养液的粘度下降快，菌落周围有大的透明圈，摇瓶培养液中的β-甘露聚糖酶活力达3.85 U /ml （表1）。

表1  菌株筛选结果

2.2        酶学性质的研究

2.2.1 温度对酶活力的影响：在30~70℃下测定β-甘露聚糖酶的活性，结果表明，该酶分解葡甘露聚糖的最适温度为37℃，在30~45℃都具有较高的活力（图1）。

             图1  β-甘露聚糖酶促反应最适温度

图2  β-甘露聚糖酶的温度稳定性

2.2.3  pH对酶活力的影响：配制pH3.0-6.0，0.01mol/L Na ₂HPO₄-0.005mol/L柠檬酸缓冲液,pH 7.0-8.0,0.025 mol/L磷酸盐缓冲液和pH9.0-10.0,0.05 mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液为酶促反应缓冲液，测定不同pH值下的酶活力。结果表明，酶促反应的最适pH为6.0（图3）。

图3  β-甘露聚糖酶促反应最适pH值

2.2.4  pH对酶稳定性的影响：将酶液与上述不同pH的缓冲液混合，37℃静置1h后，调pH至6.0，测定酶活力。结果表明，该酶在pH 5.O～9.0相对稳定（图4）。

图4  pH对β-甘露聚糖酶活力的影响

2.2.5  金属离子和EDTA对酶活力影响：将1mmol／L的溶液与酶液等量混合，37℃保温60min，测定酶活力。结果表明，Fe ²⁺ 、Cu²⁺对酶有强烈的抑制作用，EDTA有较强的抑制作用，NH₄ ⁺、Mg²⁺对酶有较弱的抑制作用,Na⁺对酶则有较小的激活作用（表2）。该结果与陈一平^[6]的结果相似，不同之处在于该酶也受Cu²⁺强烈抑制，实验结果表明该酶的活性中心可能含有巯基，由于EDTA对该酶的抑制较强，所以推测其酶活性需要某种二价金属离子。 

表2  化学试剂对β-甘露聚糖酶活力的影响 

3              讨论

据报道，魔芋低聚糖促进双歧杆菌生长效果优于乳果糖、大豆低聚糖及低聚异麦芽糖等低聚糖^[8]。因此，β-甘露聚糖酶最有应用前景的用途之一是用于魔芋低聚糖的生产。但是，其应用于工业生产的前提是生产出低成本的高活力酶。本研究所筛选到的菌株在培养24h后，其培养液中的β-甘露聚糖酶活力即接近最高值，培养时间比国内其他文献^{[ 2-3 ]}所报道的明显缩短。此外，该酶属胞外酶，易于提取，酶活力达3.85U /ml，稍高于国内一些文献的报道^[9]。但总的来说该酶的制备成本还太高，离实际应用的要求还有相当长的一段距离。今后除了需要进一筛选活力更高、稳定性更好的菌种之外，还应该开展固定化细胞法生产胞外β-甘露聚糖酶和固定化酶法生产魔芋低聚糖的研究，以降低生产成本。

参  考  文  献

[1]     Schimbug D., Salmann M. Enzyme handbook(4). Springer-Verlag Berlin Heideberg, 1991, 1-5.

[2] 杨文博，沈庆，佟树敏.产β-甘露聚糖酶地衣芽孢杆菌的分离筛选及发酵条件，微生物学通报，1995，22（3）：54-157.

[3] 崔福绵，石家骥，鲁茁壮.枯草芽孢杆菌中性β-甘露聚糖酶的产生与性质，微生物学报，1999，39（1）：60－63.

[4] 田亚平，金其荣.黑曲霉β-甘露聚糖酶酶学性质及其化学组成.无锡轻工大学学报，1998，17（3）：31－35.

[5] Viikari L.Kantelinen A，Ratto M a1．Enzyme in Biomass ConversationAmerian Chemial Society， 1991: 11－21.

[6] 陈一平，龙健儿等.β-甘露聚糖酶产生菌的筛选和发酵条件的初步研究，天然产物研究与开发，10 （3）：24-28.

[7]  Akino T，Nakamura  N, Horiroshi  K . Agric  Biol chem.,1988,52:773－779.

[8]  向进乐，陈文品，刘勤晋.魔芋低聚糖的研究进展，中国食品添加剂，2004 No.1.

[9]  杨幼慧, Alan M McKAY.β-甘露聚糖酶的产酶菌种、条件及部分性质研究,华南农业大学学报，2001，22（2）：86－88.