产有机磷农药降解酶菌株的筛选及酶学性质研究
2007-12-18 23:08:55   来源：食品与发酵工业   评论：0 点击：

摘　要　通过用乙酰胆碱酯酶抑制法检测有机磷农药，从土壤中分离筛选出能降解敌敌畏的7个菌株，从其中降解能力较强的菌株OPD7提取胞内酶，并进行酶学性质的研究。结果表明，该酶分解敌敌畏的最适pH为7.0，最适温度为42℃，pH稳定范围为6-8，在低于47℃时稳定；该酶也能降解乙酰甲胺磷、甲胺磷、乐果和氧化乐果。

关键词　敌敌畏　有机磷农药降解酶  酶学性质

 

有机磷农药(Organophosphates，简称OPS)具有杀虫效率高、防治范围广、成本低等特点，在保护农作物免受病虫草害侵染、提高粮食产量等方面发挥了巨大作用，大大促进了农业生产^[1]，但同时它们也对人类赖以生存的环境造成了严重的污染，而且经常导致蔬菜和水果等农产品农药残留超标，直接危害人们的身体健康^[2]。因此，当前迫切需要建立一种用于治理环境污染、去除农产品的农药残留的有效方法。目前最有潜力的有效方法之一是生物技术的方法：利用能够降解农药的微生物来治理受农药污染的环境，利用农药降解酶来清除表面农药残留超标的农产品 ^[3]，其前提是培育出能高效降解农药的菌株和制备出高效的农药降解酶。为了实现用生物学方法来解决农药残留危害的目标，建立一种快速、简便、成本低的筛选农药降解菌并从中提取降解酶的方法，是当前生物学家首先要解决的重要任务。本文旨在探索一种分离筛选能高效降解有机磷农药的微生物的简单、快捷的方法，同时对有机磷降解酶进行初步研究，为解决农药残留所造成的危害问题提供生物学基础。 

1．材料与方法 

1.1 土壤的来源

土壤取自农药厂的排污水沟和附近的农田。

1.2  乙酰胆碱酯酶从家蝇头部提取。

1.3 培养基

富集培养基(%)：NaNO₃ 2，KCl 0.5,CaCl₂ 0.05 ，KH₂PO₄ 1，MgSO₄.7H₂O 0.5，pH7.0,使用前加入适量敌敌畏浓缩液。

分离培养基(%)：KH₂PO₄ 0.5，(NH₄)SO₄ 0.5，FeSO₄  O.001g，K₂HPO₄0.2， CaC1₂0.005 ,MgSO₄.7H₂O  0.2，使用前加入适量敌敌畏浓缩液。

发酵培养基(%)：蛋白胨1.0，酵母粉0.5，NaCl 1.0， pH7.0。

1.4　菌株的富集、驯化和筛选

取2 g土样于100m1富集培养基中，加敌敌畏至100 mg/L， 37℃振荡培养24 h，所得菌液接入新的富集培养基中（接种量10%），并提高敌敌畏浓度到200 mg/L，24h后接入新的富集培养基中，敌敌畏终浓度提高至300 m g/L，如此循环至培养液中敌敌畏浓度达到500m g/L。然后，将培养液接入分离培养基（敌敌畏浓度为500mg/L）继续培养，一周后再移种一次。将富集所得菌液适当稀释，涂布于分离平板，观察是否有菌落生长，选择生长旺盛的菌落进行纯化。

1.5 敌敌畏降解酶粗酶液的提取

用发酵培养基培养菌体，离心收集菌体，用0.02mol/L, pH7.0的磷酸缓冲液洗涤后再离心，用适量磷酸缓冲液悬浮所得菌体，用JY92-II型超声波细胞粉碎机破碎细胞（工作电压220V，工作时间10S，间隔时间15S，120个循环），离心所得上清液即粗酶液。

1.6乙酰胆碱酯酶活性测定

乙酰胆碱酯酶能分解靛酚乙酸酯(红色)为靛酚(蓝色)和乙酸，靛酚的吸收峰在605nm，所以可以通过吸光度变化值来测定酶活力。

在试管中加入10μl 乙酰胆碱酯酶，470μl 0.02mol/L，pH7.0磷酸缓冲液，20μl  2%靛酚乙酸酯，混匀，37℃水浴中反应5分钟，加入500μl  95％乙醇终止反应，测OD₆₀₅，计算酶活力。

1.7乙酰胆碱酯酶抑制法检测农药残留

在试管中加入470μl不同浓度的有机磷农药（对照管加dH₂O）, 10μl 乙酰胆碱酯酶，混匀，于37℃水浴中反应10分钟，加入20μl靛酚乙酸酯，混匀，37℃反应5分钟，加入500μl 95％乙醇终止反应，测OD₆₀₅。计算酶的抑制率，以农药浓度的对数为横坐标、抑制率为纵坐标作出标准曲线。

抑制率的计算公式为:

I= (Uo一U_I) /Uo ×100%

其中 Uo：未受抑制的酶活力，

U_I：受农药抑制的酶活力。

1.8有机磷农药降解酶酶活力的测定

 取470μl粗酶液，加敌敌畏至1000 mg/L，37℃反应30分钟，沸水中加热5分钟终止反应，然后用酶抑制法测定农药残留。

酶活力单位定义： 在37℃，pH7.0的条件下，每分钟分解0.1µg敌敌畏所需的酶量为一个酶活单位(U)。

2.结果与分析

2. 1　菌株的筛选

通过驯化和筛选,分离出7株能降解敌敌畏的菌株。

2．2 有机磷农药降解酶在细胞上的定位

     菌液离心后取上清，将菌体重悬浮于0.05 mol/L，pH7.0的磷酸缓冲液中，得菌体液，取其中的一部分进行超声波破壁，离心所得上清即为破壁菌液，分别测定上清、菌体液和破壁菌液的敌敌畏降解酶的酶活性，结果表明，只有破壁菌液有酶活性，这说明该酶是胞内酶。

2. 3　各菌株有机磷农药降解酶活力的测定

    破壁收集各菌株的粗酶液，测定酶活力，结果表明，菌株OPD7的酶活力最高（表1），所以选它来进行酶学特性的研究。

表1  各菌株有机磷农药降解酶的酶活力比较 

2. 4  OPD7菌株的敌敌畏降解酶的酶学性质的研究

2.4.1 温度对酶活力的影响

在不同的酶促反应温度下测定酶活力，结果表明，最适反应温度为42℃，温度在低于42℃时，酶活性随温度的升高而上升(图1)。

图1  温度对敌敌畏降解酶活力的影响

2.4.2 酶的热稳定性

在不同的温度下处理酶液20分钟，测剩余酶活力，结果表明，在低于47℃时酶的稳定，但超过47℃后酶活力便急剧下降（图2）。       

       

                      图2  敌敌畏降解酶的热稳定性

 

2.4.3 pH对酶活力的影响

在不同的酶促反应pH下测定酶活力，结果表明，其最适反应pH为7.0，在pH 6-8的范围内相对酶活力均在90%以上（图3）。

 

                图3  pH值对敌敌畏降解酶酶活力影响

 

2. 4.5  酶的pH稳定性

     图4所示为酶的pH稳定性曲线，从图中可以看出，在不同的pH下保温20分钟后酶的相对活力变化很大，在碱性条件下酶活降低很多。

       

图4  敌敌畏降解酶的pH稳定性

 

2.4.6 酶的专一性的研究。

有机磷农药降解酶能够破坏有机磷的磷脂键而使其脱毒，由于各种有机磷农药的结构相似，只是取代基不同，所以通常一种有机磷降解酶可降解多种有机磷农药，所以我们进行了4种有代表性的有机磷农药酶促降解实验，结果表明，OPD7菌株所产的敌敌畏降解酶都能降解乙酰甲胺磷，甲胺磷，乐果，氧化乐果（表3），说明该菌株对有机磷农药的降解具有广谱性，值得进一步研究。

 

     表 3   敌敌畏降解酶对不同农药的降解

 

　反应时间（分钟）　 10             10            10            10

 

 

3.讨论

 

目前国内已广泛采用胆碱酶抑制法来检测农产品的农药残留^[4,5,6]，该方法的最大特点是简单、快速，灵敏度也比较高，由于乙酰胆碱酯酶能分解靛酚乙酸酯(红色)为靛酚(蓝色)和乙酸，所以可以极其简单地通过目测观察颜色的变化来判断有机磷农药浓度的高低，通过比色法来定量测定也比较简单。本文首次将该法用于有机磷农药降解菌的筛选以及酶活性的测定， 起到了减少工作量、提高工作效率、降低研究成本的作用。

本文通过在培养基中添加敌敌畏来筛选有机磷降解菌，从所得的菌株提取所得的酶同时也能分解甲胺磷和乐果等其它有机磷农药，该结果与其他学者的研究结果相同^[4] 。我们所筛选到的菌株所产的有机磷降解酶属胞内酶，该结果与                            伍宁丰学者的研究结果相同，只不过从实验结果来分析，我们认为该酶并非定位于细胞膜上。由于工业上提取胞内酶的难度很大，再加上酶活性还不够强，所以本研究所获的菌株的应用价值还不大。今后应进一步筛选能分泌胞外高活力酶的菌株，提高其应用价值。

 

 

参考文献

[1] 农业部农药检定所.新编农药手册[M].北京:农业出版社,1989,398．

[2] 梁俏娟,罗刚.急性有机磷农药中毒心电图和心肌酶改变的临床观察与分析[J].广西医学,2003,25(6):906-908.

[ 3] 张从,夏立江.污染土壤生物修复技术.北京:中国环境科学出版社, 2000.

[ 4] 刘世文,侯云修,陈佳荣,等.纯化乙酰胆碱酯酶抑制法测定游离有机磷.

现代检验医学,2005,20(2)7-9.

[ 5 侯学文,何衍彪,徐汉虹.胆碱酯酶抑制法检测辛硫磷农药残留.

河北师范大学学报(自然科学版),2003,27(2):181-184.

[6] 温艳霞,李建科.酶抑制法在农残检测中的应用及乙酰胆碱酯酶的研究进展.食品研究与开发,2005,26(1):130-132.