木聚糖酶产生菌的选育
2007-12-18 21:39:19 来源：本站原创 评论：0 点击：
摘 要: 经过两步平板分离法,筛选到1株木聚糖酶高产菌,三角瓶发酵培养后,测得该菌的酶活力为0.2535U/mL,酶最适反应温度为60℃,最适反应的pH值为6.0。
关键词：两步平板分离法；木聚糖酶；选育
作者简介：成显波（1982－），男，广西罗城人，工学学士，广西大学2004级硕士，从事蔗渣浆木聚糖酶辅助漂泊研究。
木聚糖酶是一类木聚糖降解酶系，属于水解酶类，包括内切β－木聚糖酶、外切β－木聚糖酶和β－木二糖苷酶。自然界中，能合成木聚糖酶的微生物有细菌、放线菌和真菌。木聚糖酶用于纸浆漂白是用木聚糖酶来降解木素 — 碳水化合物的复合体，为后续漂白段提供条件[1]。
常规含氯漂泊的制浆造纸工业因严重污染环境和威胁人类健康，受到了政府和人们的高度重视，控制污染、减少危害势在必行。北欧和北美等国家的多家纸厂在制浆过程中成功采用木聚糖酶生物漂泊纸浆，有效的控制了环境污染和提高的纸品质量。而我国对木聚糖酶助漂的研究起步较晚，目前尚处于实验室研究阶段，由于所选菌株本身的适应性及所产酶的性质等方面的问题，工业应用尚未形成规模[2]。这种高投入、高风险、低回报的行业特性，使得木聚糖纸浆助漂研究往往是止步不前。
本研究以广西支柱产业——造纸制浆业为研究方向，采用低成本的两步平板分离法从大自然筛选能分解蔗渣木聚糖、用于蔗渣浆辅助漂泊的产酶菌，并研究该菌粗酶液的特性。目的是为工业化应用木聚糖酶助漂制浆提供理论依据。
1 料和方法
1.1 材料
1.1.1 土样
从广西大学农场甘蔗地、南宁糖纸厂和良庆造纸厂堆料场处采样分离
1.1.2 试剂
木聚糖:华木木聚糖,Sigma 公司。
蔗渣半纤维素:从蔗渣中制备提取。
1.1.3 培养基
富集培养基(%)：蔗渣半纤维素3.0,蛋白胨 0.5, NaCl 0.5,PH自然。
分离培养基A(%)：蔗渣半纤维素3.0, KNO3 0.1,MgSO4.7H2O 0.05,NaCl 0.05, K2HPO4 0.05, 琼脂 2, pH 9.5。
分离培养基B(%)：华木木聚糖3.0, KNO3 0.1,MgSO4.7H2O 0.05,NaCl 0.05, K2HPO4 0.05, 琼脂 2, pH 9.5。
斜面培养基(%)：牛肉膏0.5,蛋白胨1, NaCl0.5, 琼脂 2, PH自然。
种子培养基(%)：蔗渣半纤维素1.0,蛋白胨 1.0, NaCl 0.4, MgSO4 0.05, K2HPO4 0.05, pH 8.5。
发酵培养基(%)：甘蔗渣粉3.0， NH4Cl 0.5， MgSO4.7H2O 0.1，KH2PO4 0.05，Na2HPO4 0.05，pH 8.5。
1.2 实验方法
1.2.1 甘蔗渣粉的制备
取甘蔗渣，经粉碎机粉碎后，过40目筛子即得到甘蔗渣粉。
1.2.2 甘蔗渣半纤维素的制备[7]
甘蔗渣用5％的NaOH浸泡（NaOH的用量以浸没沉淀为度）。400C保温16h后过滤（用90度的水连续处理3次），取滤液，用99％乙酸调PH至5.5，然后加入适量的95％工业酒精，放入冰箱中冷却5h后离心，用纯水洗涤沉淀两次，离心后即可得到半纤维素沉淀物（泥状）。
1.2.3 产木聚糖酶菌株筛选[3].[4].[5]
分离培养：对透明度高的富集培养液稀释到一定倍数，准确移取1ml稀释液涂布于分离平板A上，培养4－7天，挑取透明圈较大而且明显的菌株转接到分离平板B上培养,出现透明圈的菌落即为所需要的产木聚糖酶菌，再选出透明圈大且明显的菌株转接到斜面培养基保存。
摇瓶发酵：把分离后保藏的菌种接到种子培养基中培养24h（37℃、160rpm），取10ml菌液加入发酵培养基中，于37℃、160rpm/min摇床培养，96h后，取发酵液测酶活，比较各菌发酵液的酶活，找出酶活较高的菌株。
1.2.4 木聚糖酶活力的测定[7]
发酵液5000r/min离心10min得上清液，即为粗酶液，适当稀释，试管中加入1%的华木木聚糖1.8ml，40℃保温5min，加入0.2ml酶液，40℃准确反应40min，加入1.5mlDNS试剂，混合均匀于沸水浴中保温5min显色，迅速冷却，加21.5ml蒸馏水，混匀。空白管先加0.2 ml酶液，沸水浴中保持5min，使酶失活，再加入1.5mlDNS试剂和1.8ml 1%的木聚糖，混合均匀沸水浴中保温5min显色，迅速冷却，加21.5ml蒸馏水，混匀。在λ=520nm处测OD值，通过标准曲线得出酶活单位。
酶活力单位定义为：以木聚糖为底物，每分钟释放1µg相当于木糖的还原糖所需的酶量为一个酶活单位(U)。
1.2.5 木聚糖酶粗酶液特性研究[5]
木聚糖酶最适温度：测定不同温度条件下酶提取液的酶活。
木聚糖酶最适pH：测定不同pH缓冲液条件下酶提取液的酶活。
2 结果与分析
2.1 菌株筛选
根据富集培养的方法，富集培养液透明度高说明在本条件下存在分解半纤维素的菌株，因此缩小了目标范围，减少工作量。富集培养液液经稀释后涂布到蔗渣半纤维素的分离平板A上，分离得到40株能产半纤维素酶的菌株进行初筛。把初筛菌株接到木聚糖分离培养基B上，待长出菌后在平板上选择圈大而透明度好的9株能产木聚糖酶的菌株进行摇瓶发酵培养。见图2.1。
图2.1 两步平板分离
图2.1观察，在平板A长透明圈的菌，转接到平板B，部分菌出现明显透明圈，部分菌的透明圈不明显，还有部分菌只是长菌而没有透明圈出现，更有些菌没有生长或者长得比较小。实验表明，利用两步平板分离法，减少筛选的成本及工作量，缩小了目标菌株范围，提高准确度和筛菌效率。
把筛选得到的菌株接入种子培养基培养24h，取10ml菌液加入发酵培养基培养，培养96小时后测酶活，得到各菌株的酶活见表2.1。
表2.1 各菌株的酶活
|
菌株 |
木聚糖酶活力（U/ml） |
菌株 |
木聚糖酶活力（U/ml） |
|
1 |
0.4501 |
6 |
0.1342 |
|
2 |
0.5297 |
7 |
0.2972 |
|
3 |
0.0128 |
8 |
0.0292 |
|
4 |
0.3534 |
9 |
0.0412 |
|
5 |
0.2605 |
10 |
0.0368 |
从表2.1中可看出有5株酶活较高的菌分别为1、2、4、5、6、7号菌，将这六株菌发酵培养，从中选出酶活力最高的发酵液做酶液的性质的研究，培养96小时后测酶活，得到各菌株的酶活见表2.1。
表2.2 各菌株的酶活
|
菌株 |
木聚糖酶活力（U/ml） |
菌株 |
木聚糖酶活力（U/ml） |
|
1 |
0.0999 |
5 |
0.2535 |
|
2 |
0.0323 |
6 |
0.0436 |
|
4 |
0.2077 |
7 |
0.1960 |
由表2.1和2.2结果看出1、2号菌很不稳定，而5号菌是最稳定而且酶活力相对较高的一株菌，所以选用5号菌来进行酶活性的研究。改变温度、pH值，测得5号菌株的酶活情况，结果如图2.2，2.3。
2.2 木聚糖酶粗酶液特性
2.2.1 温度对木聚糖酶的影响
在不同的酶促反应温度下对木聚糖酶酶活力进行测定，其结果如图2.2所示。
图2.2 温度对酶活的影响
由图中可以看出,随着反应温度的升高，酶分子被激活，酶活力逐渐增大，当温度达到60℃时，酶活达到最高，当温度继续上升，酶蛋白在高温下发生变质，酶活力随之降低。
2.2.1 pH对酶活力的影响
在不同的酶促反应pH下对木聚糖酶酶活力进行测定，其结果如图2.3所示。
图2.3 pH值对酶活力影响
实验结果表明，5号菌株所产木聚糖酶的最适酶促反应pH在5.0～7.0范围内，其中以pH6.0为最适pH。
3 讨论
利用蔗渣半纤维素分离平板和木聚糖分离平板两步筛选法,不仅可以快速、准确的筛选出能分解蔗渣木聚糖的产酶菌,还能减少昂贵华木木聚糖的用量，降低筛菌成本，同时蔗渣木聚糖制备工艺简单，无需过多投入，为木聚糖酶助漂蔗渣浆研究奠定基础。通过两步分离法，发现许多菌株在蔗渣半纤维素分离平板产生透明圈，转接到木聚糖分离平板培养并没有出现透明圈，这是因为蔗渣半纤维素的成分除了含木聚糖以外，还含有很多其他寡糖，比如甘露糖、阿拉伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖和木葡聚糖等多种组分，因此，筛出的菌株除了有木聚糖酶产生菌，还可能含有其他半纤维素酶产生菌，因此需要次经过木聚糖分离平板复筛。
本文主要是尝试两步法筛选木聚糖酶高产菌株，同时还研究了5号菌木聚糖酶粗酶液特性，为往后的蔗渣浆木聚糖酶助漂研究打下理论基础。
参考文献
[1] 刘玉新，牛梅红，汤德芳.木聚糖酶用于纸浆漂白[J].纸和造纸.2004年11月,第六期.
[2] 林 鹿，詹怀宇.纸浆漂泊生物技术[M]，北京：中国轻工业出版社，2002:205-295.
[3] 《甘蔗渣制浆》编写组.甘蔗渣制浆[M]，北京：轻工业出版社，1977:1-5.
[4] 马光庭.应用微生物学实验技术[M]，广西：广西大学农学院微生物学教研室，2000:2-4.
[5] 无锡轻工大学编.微生物学[M]，北京: 中国轻工业出版社,2001:331-362.
[6] 费笛波，冯观泉，袁 超 .食用木聚糖酶活性测定方法研究[J]. 浙江农业学报 2004,53～58.
[7] 邬义明.植物纤维化学[M].第二版.北京：中国轻工业出版社，1991：231－236.
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