β-葡萄糖苷酶高产菌株筛选
2007-11-08 21:44:48   来源：南昌高专学报   评论：0 点击：

β-葡萄糖苷酶(EC3,2,1,21),其英文名是:beta glucosidase,属于水解酶类,是一种可由黑曲霉菌分泌的胞外酶,工业上应用广泛。细胞表面结构的通透性,是细胞与环境进行物质交换的屏障。细胞借助于这种通透性实现的代谢控制方式是整个代谢系统中重要的一环。如果细胞膜通透很强,则细胞内代谢物质容易往外分泌,反之,细胞内代谢物难以分泌至胞外,使胞内终产物浓度大量增加而引起反馈调节,影响终产物的积累。制霉菌素是一种大环内脂类抗真菌剂,能与真菌细胞膜中麦角固醇结合,引起细胞膜的损伤。据此推测,制霉素抗性突变株有可能发生细胞膜透性的改变,从而增加菌体对营养物质的吸收,有利于胞内合成的β-葡萄糖苷酶向胞外的分泌,因此运用制霉菌素来筛选高渗透性变异株有可能得到β-葡萄糖苷酶高产菌。
1.材料
1.1菌株
黑曲霉。
1.2培养基
1.2.1斜面培养基
马铃薯200g,蔗糖20g,琼脂15g,水1000mL,pH自然。马铃薯去皮,切成块煮沸30min,然后用纱布过滤,再加蔗糖及琼脂,溶化后补水至1000mL。121℃灭菌20min。
1.2.2查氏培养基
0.3%NaNO3,0.05%KCL,0.001%FeSO4,0.1%K2HPO4,0.05%MgSO4·7H2O,2%蔗糖,2%琼脂,pH 6.7,121℃灭菌20min。
1.2.3制霉素抗性培养基
0.3%NaNO3,0.05%KCl,0.001%FeSO4,0.1%K2HPO4,0.05%MgSO4·7H2O,2%蔗糖,2%琼脂,在查氏培养基的基础上,加入LiC1至0.15%(w/v),并加入去氧胆酸钠使成0.8%(w/v)浓度。121℃灭菌20min后,在无菌室内将培养基放入50～60℃的水浴锅内,恒温,向其中加入不同浓度的制霉素。
1.2.4产酶培养基
麸皮5g,水5mL,pH自然,装于250mL三角瓶中,121℃灭菌20min。
1.3试剂
制霉素(50万单位/片),购于浙江震元制药厂;LiC1,购于天津化工厂;水杨苷,购于中国药品生物制品检定所;其它试剂均为分析纯。DNS试剂的配制[4]:准确称取酒石酸钾钠300.0g完全溶于500mL蒸馏水中,标记为A试
液。准确称取氢氧化钠16.0g完全溶于250mL蒸馏水中,标记为B试液。准确称取3,5-二硝基水杨酸10.0g完全溶于B试液中,标记为C试液。将C试液和A试液混合用蒸馏水定容至1000mL,标记为DNS试剂。DNS试剂用棕色瓶放置7天后,用细纱布过滤蔽光保存。0.1M pH=4.8醋酸-醋酸钠缓冲液的配制:溶液A:量取冰醋酸6mL,定容至1000mL,制成0.1M醋酸溶液。溶液B:称取8.2g醋酸钠,溶解后容至1000mL,制成0.1M醋酸钠溶液。使用是以A∶B=4∶6的比例混合,低温冷藏备用。
1.4主要仪器

净化工作台(上海跃进医疗器械厂);THZ-82恒温培养箱(常州国华仪器厂);752型紫外分光光度计(上海分析仪器厂)。
2实验方法
2.1斜面培养方法
保存菌种接入斜面培养基,30℃恒温培养5天。
2.2紫外线合适照射剂量的选择方法
取浓度为1×105/mL的孢子悬液10mL于无菌平皿(9cm)中,将平皿置于磁力搅拌器上,分别作40、60、80、120、150、180、240 s和300s紫外线照射处理(紫外灯事先预热20min,紫外灯功率25W,照射距离30cm),同时设立未照射处理对照组,紫外线处理后的孢子悬液用黑布包裹避光过夜。
对上述孢子悬液进行系列稀释,取各浓度孢子悬液0.1mL涂平板,30℃恒温培养,3天后计数并计算存活孢子数,计算不同照射时间的相对致死率。选择致死率为70%～80%的紫外线照射剂量,对孢子进行诱变。
2.3制霉素最小抑制浓度选择方法
配制制霉素浓度(U/mL)分别为20、40、60、80、100、120、140、200、220的平板,每组三个平行;取斜面孢子一环于10mL无菌水中摇匀制成孢子悬液,记为100,分别稀释至10-1,10-2,10-3,10-4,取浓度为10-3的斜面孢子悬液0.1mL分别涂布于制霉素平板,30℃恒温培养,3天后观察结果,选择完全抑制黑曲霉菌丝生长的最小制霉素浓度。
2.4出发菌株的诱变及抗性株筛选
取斜面孢子一环于10mL无菌水中摇匀制成孢子悬液,记为100,分别稀释至10-1,10-2,10-3,10-4,取10mL 10-3的孢子悬液至无菌培养皿(9cm)中,置磁力搅拌器上,用致死率70%～80%的紫外线剂量照射,然后吸取0.1mL照射过的孢子悬液,涂布于含完全抑制黑曲霉菌丝生长的最小制霉素浓度的平板上,30℃恒温培养,3天后挑取在抗性平板里生长良好的菌落,作为抗性株。
2.5高产β-葡萄糖苷酶菌株筛选
将在抗制霉菌素平板上生长良好的菌落转接至查氏培养基平板上,30℃恒温培养3天。3天后选取长势良好的单个菌落用无菌接种环接于斜面培养基上,30℃恒温培养6天。6天后,将斜面培养的菌丝体切小块,接种于固体发酵培养基,振荡三分钟使孢子均匀分布在固体发酵培养基上,30℃恒温静置培养6天。6天后,用0.1MpH=4.8醋酸-醋酸钠缓冲液60mL 4℃浸提发酵物2h,浸提液离心所得上清即为粗酶液,测β-葡萄糖苷酶活力,筛选酶活力最高的菌株为出发菌株。
2.6β-葡萄糖苷酶活力测定方法
取0.5 mL酶液,加入0.5mL 0.5%水杨苷(溶于0.1M pH=4.8醋酸-醋酸钠缓冲液),55℃保温20min后,加入1mL DNS试剂,混合后在沸水中煮沸5min,冷却后加蒸馏水稀释至10mL,用分光光度计于520nm测OD值,以加热灭活的酶液按同样方法处理作空白,上述条件下,定义:每小时由底物产生1?mol还原糖(以葡萄糖计)所需酶量为一个酶活单位U。
3结果与讨论
3.1紫外线照射剂量的选择
本文以相应条件下的紫外线照射时间作诱变剂量,适宜剂量则以对黑曲霉孢子的致死率为指标进行选择。紫外线照射剂量与黑曲霉孢子致死率关系如图1所示,紫外线对黑曲霉孢子致死作用明显。在200s处,致死率为78.6%,选定200s作为适宜诱变剂量,对黑曲霉孢子进行紫外线-氯化锂复合诱变。(相对致死率=(未处理存活孢子数-处理组存活孢子数)/未处理组存活孢子数×100%)

3.2制霉素最小抑制剂浓度选择
当取浓度为10-3的斜面孢子悬液0.1mL,涂布于含有不同浓度制霉素平板,30℃恒温培养3天后观察,结果表明在制霉素浓度为20U/mL和40U/mL的平板上,培养基中菌体生长状态与出发菌株基本相同;当制霉素浓度>40U/mL时,菌体生长受到明显抑制;在制霉素浓度>100U/mL的培养基上,菌体不生长。因此选定制霉素100U/mL为最小抑制剂浓度。菌体生长情况见表1。

3.3葡萄糖标准曲线的制定
标准曲线的制定:分别吸0.1%的葡萄糖溶液0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL于试管1,2,3,4,5,6号,用蒸馏水将每支试管加水到1mL,再加1mL DNS试剂,混合后在沸水中煮沸5min,冷却后用蒸馏水稀释至10mL,用分光光度计在波长520nm测OD值,以1号试管为对照,得回归方程:Y=17.878X,γ=0.9939

3.4诱变株β-葡萄糖苷酶活力比较
紫外线-氯化锂复合诱变黑曲霉之后,选取13株在查氏培养基上长势良好的单菌落。挑取单菌落,经斜面培养和固体发酵培养后,用0.1MpH=4.8醋酸-醋酸钠缓冲液浸提发酵物得粗酶液,测β-葡萄糖苷酶活力。比较对照及这13株菌的产酶活力,得出IK-7产酶活力最高达118.95 U/mL,比对照提高了将近6倍。

4结论
以黑曲霉为出发菌株,经紫外线-氯化锂变得13株长势良好的单菌落。通过水解水杨产还原糖方法测定这13株菌固态发酵产β-萄糖苷酶活力,结果表明,IK-7产酶活最高,达118.95 U/mL,比对照提高了将近6倍。