两株溶磷黑曲霉的生长特性及对不同难溶性磷酸盐的溶解作用
2007-06-10 00:18:02   来源：本站原创   评论：0 点击：

刘晓芳?1，黄晓东?2，刘　晔?3

(1．山东商业职业技术学院，山东济南　250103；2．山东省生物药物研究院，山东济南　250014；3．山东轻工业学院，山东济南　250100)

摘要：通过发酵培养实验对ML2、ML4两株溶磷黑曲霉的生长特性及对不同难溶性磷酸盐底物的溶解作用进行了研究。绘制了溶磷曲线，产酸、残糖变化曲线，菌体生长曲线，同时，结果表明：两株曲霉对Ca₃(PO_４)₂、CaHPO?4、FePO?4、ALPO_４,均有较好的溶解作用，说明它们可以适用于不同的土壤。

关键词：溶磷微生物;溶磷能力;难溶性磷酸盐?

中图分类号：Q599　　　文献标识码：A　　　文章编号：1000-2324(2005)02-0232-03

收稿日期：2004-06-23?

作者简介：刘晓芳(1970-)，女，讲师，在职硕士研究生，主要从事应用生物技术方面的研究。

GROWTH CHARACTERISTIC OF TWO ASPERGILLUS NIGER STRAINS AND THE DISSOLVING ?EFFECTS ON DIFFERENT ISOLUABLE PHOSPHATES

LIU Xiao-fang?1，  HUANG Xiao-dong?2，LIU Ye?3

(1．Shandong lnstitute of Commerce and Technology,Jinan 250103，Shandong, China；2．Institute of Biopharmaceuticals OfShandongProvince，?Jinan 250014，Shandong，China；3．Shandong lnstitute OfLight lndustry，Jinan 250100，Shandong，China)

Abstract：The growth characteristic of Aspergillus niger ML2、ML4 and their ability of dissolving different isoluable phosphates were studied in this work．Several figures such as the ability of dissolving phosphate，acid production，remnant glucose were concluded． It showed that these two Aspergillus niger were efficient to dissolve Ca₃(PO_４)₂、CaHPO_４、FePO_４、ALPO_４，which indicated their applicability of different soil． ?

Key words：Phosphate-solubilizing microorganisms; ability of phosphate solubilization; isoluable phosphates

　　磷是植物生长必需的营养元素之一，虽然土壤中磷的含量很高，但却不能为植物很好利用，其主要原因是土壤中的磷大都以不溶性的无机磷酸盐形式存在，而存在的有机磷也必须通过矿化作用先转化成游离磷酸盐，再与土壤中的金属离子结合，生成不溶性的磷酸盐，如磷酸铁、磷酸铝、磷酸三钙。由于土壤的固定作用，使施入土壤中的磷肥转化成难溶性的化合物，其当季利用率一般不超过25％［1］。所以，提高土壤中磷的利用率成为农学家关注的问题。溶磷微生物的研究一直以来受到科学家的重视，以期通过微生物菌肥的方式提高土壤中难溶性磷的有效性和菌肥的利用效率［2］。本文对已筛选到的两株高效溶磷菌株的生长特性及对各种难溶性磷酸盐的溶解作用等进行了研究，以期对溶磷微生物肥料的应用提供可靠的理论依据。

1　材料与方法

1．1　菌株

　　黑曲霉ML2、ML4，从贫瘠的农田土壤中分离筛选而得，其分离过程见参考文献［3］。

1．2　培养基

　　无机磷培养基　葡萄糖10g，(NH_４)₂SO_４0．5g，NaCl 0．3g，KCl 0．3g，MgSO_４．7H₂O 0．3g，FeSO_４．7H?2O 0．03g，MnSO_４4H₂O 0．03g，Ca₃(PO_４)₂10g，蒸馏水1000mL pH 7．0。

　　PDA培养基　马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。

　　以上培养基均以121℃，20min灭菌。

1．3　方法

1．3．1　菌液制备　将PDA上培养7d的霉菌孢子刮入无菌水中，制成孢子悬浮液，浓度约为10⁸cfu／rnL。

1．3．2　菌株的生长特性研究　向500mL三角瓶中加入100mL无机磷培养基，接入2mL孢子悬浮液，同时做不接种对照(培养基中加入2mL无菌水)，30℃培养7d(160r／min)，每隔24h测定发酵液的pH值、残糖、溶磷、菌重，作出酸度变化曲线、残糖变化曲线、溶磷曲线和菌体生长曲线。

1．3．3　对其它不溶性磷酸盐底物的溶磷效果测定　将培养基中的难溶性磷酸盐Ca₃(PO_４)₂替换为CaHPO_４·2H₂O、AIPO_４和FePO_４·4H₂O，按加入相同当量磷计算加入量，培养后测定溶磷量。

1．3．4　测定方法　①酸度测定　发酵液10000r／min离心20min，直接用酸度计测定上清液中的pH值。②残糖的测定　将发酵液10000r／min离心20min，取上清液，用DNS法［4］(3，5-二硝基水杨酸比色法)测定还原糖的含量。③可溶性磷的测定　将发酵液10000r／min离心20min，取上清液，用钼磷比色法［5］测定可溶性磷的含量。④菌体质量的测定　培养液用烘至恒重的滤纸过滤，并用0．1mol／L的HCI洗涤，溶解去除剩余的不溶性磷酸盐后，用无菌水冲洗3次，在80℃的烘箱中保持8h，冷却后称重。

2　结果

2．1　菌株ML2、ML4生长特性研究

　　将ML2、ML4 30℃摇床培养，测定发酵液pH的变化，结果见图1。

　　由图1的pH变化曲线可以看出，在发酵过程中，ML2、ML4两株菌的pH下降都十分迅速，两天便都降到了4以下，ML4最低pH值达到了2．5，随着培养时间的延长，pH值又略有上升。

　　图2所示了菌株ML2和ML4菌体量随培养时间的变化趋势，由菌体生长曲线可以看出，ML2、ML4两株菌在经过一天的迟缓期后，马上进入指数生长期，菌体量增长迅速，并分别在第3、第4天先后进入稳定期。ML4比ML2的指数生长期稍长。菌体生长量在第4天前后达到最大。

　　由图3的残糖变化曲线可以看出，发酵液的糖浓度下降迅速，第二天就分别下降到0．826mg/ml、0.408mg/ml。

　　菌株ML2和ML4的溶磷曲线见图4。两株菌在第2、3、4天的菌体生长指数期溶磷迅速，第4天后溶磷速度明显减缓。可以看出溶磷与菌体生长有密切的联系。

2．2　对其它难溶性磷酸盐底物的溶解效果测定?

　　两株菌对各种难溶性磷酸盐的溶解效果见图5。可以看出，ML2、ML4不但对Ca_３(PO_４)₂有较高的溶磷率,而且对其它难溶性磷酸盐都有较好的溶磷效果,尤其是ML4对CaHPO_４和ALPO_４的溶磷百分率也高达70％以上。由于Ca_３(PO_４)₂、ALPO_４和FePO_４为土壤中难溶性磷酸盐的主要存在形式，说明这两株菌可适用于不同的土壤。

3　小结?

　　(1)结果表明：在发酵过程中，两株菌发酵液的pH下降都十分迅速，菌体生长量在第四天前后达到最大，残糖下降十分迅速，溶磷量在菌体生长指数期增长迅速，第六天达到最高，可见，菌株的溶磷与菌体生长关系密切。另外，两株菌在溶磷过程中都伴随着pH值不同程度的降低，这可能与菌株在发酵过程中有机酸的产生和H?+质子的释放有关［6］。

(2)土壤中无机磷的形态主要有原生矿