混合菌种固态发酵法发酵豆粕生产大豆肽的研究
2009-09-29 14:22:53   来源：本站原创   评论：0 点击：

山东轻工业学院食品与生物工程学院/姜 曼  宋俊梅

摘 要  大豆肽是由大豆蛋白经水解所得到的由3～6个氨基酸残基组成的低分子肽混合物，分子量以低于1000Da的为主。以豆粕为原料，采用黑曲霉、米曲霉混合菌种固态发酵法生产大豆肽，制得的大豆肽具有较好的理化特性和生理活性，克服了酶解法产品苦味大和口感差等缺点，在很多领域得到了广泛应用。

关键词  大豆肽；固态发酵；豆粕。

1  大豆肽的生产

大豆肽的生产主要有酶解法和微生物发酵法。酶解法具有产品安全性高、生产条件温和、水解易控制、可定位生产特定的大豆肽等优点，但其缺点是大豆蛋白利用率不高。仅限于少数几种微生物蛋白酶、动物蛋白酶和植物蛋白酶，酶解产肽率相对较低且成本高，肽酶价格和脱苦成本都相应增加。近年来微生物发酵法广泛应用于大豆肽的生产制备，因其把蛋白酶的发酵生产和大豆肽的酶解生产结合在一起，降低了大豆肽的生产成本。微生物发酵法生产大豆肽主要利用的是发酵菌株的产酶及酶解能力，目前应用较广的微生物主要是枯草杆菌1389、放线菌166、栖土曲霉3942、黑曲霉3350和地衣型芽抱杆菌2709等。应用于微生物发酵生产大豆肽的技术方法目前主要有固态发酵技术和液态发酵技术两种。

液态发酵液产品提取后产生大量的废液，生产规模越大，废液越多，污染越重^[1]。这时人们又不约而同地把眼光投向了古老的固态发酵技术，该技术具有节水、节能的独特优势，且没有废液产生，属于清洁生产技术。应用现代固体发酵技术能实现大规模生产，而且其投资规模和生产成本往往要比液态法低，更重要的是现代固态发酵往往没有影响环境的污染废物产生，在食品加工业中将发挥越来越重要的作用。固态发酵其中一个重要应用领域就是利用微生物转化农作物及其副产物，以提高它们的营养价值，减少对环境的污染。经研究表明，豆粕经固态发酵可有效提高蛋白质的生物转化率。

2  混合菌种固态发酵法生产大豆肽的工艺

2.1 菌种及原料

菌种：黑曲霉AS3.350，米曲霉A-9005(山东大学微生物实验室提供)。

原料：豆粕、麸皮(山东万得福集团生产)。

斜面培养基(黑曲霉AS3.350查氏培养基)：NaNO₃ 0.2g、K₂HPO₄ 0.1g、KCl 0.05g、MgSO₄ 0.05g、FeSO₄ 0.001g、蔗糖3.0g、1.5～2.0g琼脂，蒸馏水100mL，自然pH值。

液体活化培养基(黑曲霉AS3.350查氏培养基)：NaNO₃ 0.2g、K₂HPO₄ 0.1g、KCl 0.05g、MgSO₄ 0.05g、FeSO₄ 0.001g、蔗糖3.0g、蒸馏水100mL，自然pH值。

固态发酵培养基：豆粕，装量为 50mL/250mL 三角瓶。灭菌后接入菌种，振荡培养。 

2.2 大豆肽生产工艺

采用黑曲霉AS3.350、米曲霉A-9005混合菌种固态发酵低温脱脂豆粕生产大豆肽。

其工艺流程为：

                              菌种活化     通氧

                                ↓          ↓

配制豆粕发酵培养基→灭菌→冷却(接菌)→发酵→分离→真空浓缩→喷雾干燥→筛分→成品 

2.2.1 菌种活化  斜面活化菌种转接到液体活化培养基中。因黑曲霉、米曲霉需活化36h后方可达到菌体生长对数期，因此于30℃，200rpm振荡培养36h，待生成均一小菌丝球时可用于发酵。

2.2.2 配制固态发酵培养基  将豆粕粉碎为细度100μm的颗粒，按65%含水量配制发酵基质，豆粕与麸皮按10:1的比例装于250mL三角瓶中，加入蒸馏水20mL与之混合，自然pH值。搅拌，使混合液均匀。121℃、20min灭菌，待用。 

2.2.3 固态发酵  发酵培养基自然降温至 25～28℃。按发酵混合液总量的10％，将黑曲霉AS3.350、米曲霉A-9005按合适的接菌比例接入并摇匀。于32℃、200rpm摇床培养。发酵过程中按一定比例向发酵液中通入压缩空气，以提供发酵过程中需要的氧气，并不断搅拌，使物料液发酵充分和均匀。发酵过程中发酵液的 pH值应保持在5.4～6.6的范围内，出现异常时，用 HCl及 Ca(OH)₂进行调节。 

2.2.4 分离  采用离心方式对发酵液中浆渣进行分离，上清液用于生产大豆肽。

2.2.5 脱苦、脱色  采用脱色活性炭吸附或超滤处理。活性炭吸附法是常用的大豆肽脱苦、脱色方法。一般采用固液比1:10 ，温度40℃～50℃，搅拌30min，冷却后过滤，可得到较好的口味，溶液透明澄清。用超滤膜处理，可控制大豆肽分子质量在2000Da左右，对水解不到位大豆蛋白质进行截留，同时进一步纯化大豆肽。

2.2.6 纯化  目前大豆肽的分离纯化方法主要有：凝胶过滤法、正交轴逆流色谱法、高效液相色谱法、离子交换色谱、超滤等方法^[2~4]。本试验采用Sephadex G-15凝胶过滤层析对大豆肽进行分离纯化。凝胶层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶，对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术。将6000Da以下的肽通过Sephadex G-15进行分离。用0.1mol pH7.2磷酸盐缓冲液，以3mL/10min流速洗脱，收集分子量1200Da以下的肽段。

2.2.5 真空浓缩  分离精制后的大豆肽溶液首先经135℃、5s的超高温瞬时杀菌，然后在86～89kPa的真空度下进行真空浓缩，得到固形物含量25％～40％左右的成品大豆肽浓缩液，为澄清的浅黄色溶液。 

2.2.6 喷雾干燥  浓缩液经喷雾干燥塔气流喷雾干燥后呈颗粒状，其水分含量≤8％。 

2.2.7 筛分  将粉末和大颗粒团分离进行粉碎，经筛分后合格品进行定量包装。 

2.2.8 成品  产品进行定量包装后经检验可入库储存。

3  大豆肽的质量标准

3.1 常规质量指标

表1  大豆肽的常规质量指标

注：pH为 1:10溶解在水中的测试结果。

3.2 卫生指标

表2  大豆肽的卫生指标

4  混合菌种固态发酵法生产大豆肽的特点

4.1 豆粕中营养因子的去除

豆粕中存在胰蛋白酶抑制剂、植酸、大豆凝血素、低聚糖、脂肪氧化酶、大豆抗原蛋白(致敏因子)及致甲状腺肿素等多种抗营养因子^[5]。抗营养因子对成分的消化、吸收、代谢以及动物的健康和生产性能产生不良影响。将豆粕通过微生物发酵处理后，豆粕中的各种抗原成分、抗营养因子被有效降低去除，豆粕中的蛋白质被分解成大量的植物小肽。 

4.2 生产成本低廉

在微生物发酵豆粕粉过程中产生丰富的蛋白酶，将豆粕粉中的大豆蛋白分解成多肽。以特异性地切断疏水性多肽末端的两种疏水性氨基酸，降低了多肽溶液的苦味值。因此，固态发酵法生产大豆肽将大豆蛋白的水解与大豆肽的脱苦步骤合二为一，很大程度上节省了时间，降低了成本^[6]。

4.3 改善口感

采用微生物发酵法生产大豆蛋白活性肽。通过微生物作用对某些苦味肽基团进行修饰和重组，使小肽之间、小肽与氨基酸之间发生移接、重排。制得的大豆蛋白活性肽无苦味和异味。口感好，克服了酶解法产品苦味大和口感差等缺点^[7]。产品可广泛用于食品和医药工业。采用该方法获得的大豆蛋白混合肽含量可达60％以上。

5  前景

大豆肽因较好的稳定性、良好的物理加工特性和易为人体消化吸收利用、以及诸多的功能特性而成为当前食品科学研究中的热点。

利用混合菌种固态发酵法生产大豆肽，成本低廉(利用豆粕作底物)；克服了酶解法产品苦味大和口感差等缺点；另外，大豆肽转化率及酶活较之单菌种固态发酵法均有所提高。

固态发酵法由于把蛋白酶的发酵生产和大豆肽的酶解生产结合在一起，降低了大豆肽的生产成本，应用前景较好。微生物在发酵过程中，微生物代谢产生的酶在降解抗营养因子和将大分子的蛋白质降解为小分子肽的同时，还可产生有机酸、细菌素和类细菌素等抑菌物质，对动物健康具有保护作用，在各个行业尤其是畜牧业中具有很好的开发应用前景。