油茶饼粕制备SCP菌种筛选发酵工艺条件研究
2008-05-21 22:43:01   来源：本站原创   评论：0 点击：

1前言

菌体蛋白^[1] 又称微生物蛋白或单细胞蛋白（缩写SCP），是指利用各种基质大规模培养细菌、酵母菌、霉菌、藻类和担子菌而获得的微生物蛋白（或菌体蛋白），是食品工业和饲料工业的重要蛋白质来源^[2]。油茶饼粕和猪血都是工业生产中的废气物，直接排放不仅污染环境，而且浪费资源。因此探索利用油茶饼粕和猪血为原料来大量培养酵母菌、霉菌以获得微生物蛋白（或菌体蛋白）是一个值得研究的课题。根据前人的研究，对培养单细胞蛋白而言，混合菌种（由若干株霉菌和酵母菌组成）的筛选和确定是很重要的一个环节，本文则主要是对筛选混合菌种用的发酵工艺条件进行了初步研究。

2  实验材料

2.1 实验原料

油茶饼粕：广州多维康食品科技有限公司提供

新鲜猪血：市售

2.2 实验菌种

黑曲霉、米曲霉、绿色木霉、白地霉、产朊假丝酵母、热带假丝酵母（均由广东微生物研究所提供）

2.3 培养基

2.3.1.斜面培养基

PDA培养基 —— 用于霉菌培养；麦芽汁琼脂培养基 —— 用于酵母菌培养

2.3.2.液体种子培养基

（1）霉菌：可溶性淀粉3.0％，葡萄糖2％，蛋白胨0.15％，(NH₄)₂SO₄ 0.5%,

KH₂PO₄ 0.3%，MgSO₄ 0.15％，自来水1000毫升

（2）酵母菌：130克麦芽汁加水1000毫升配成12 ^oBx溶液，供酵母增殖用。

2.3.3.固体发酵培养基（见实验方法）

3 实验方法

3.1 单菌种发酵法初步筛选培养基配方

优良的培养基可以为微生物的生长提供所需的全部营养素，包括C源和N源。由于米曲霉不仅能分泌淀粉酶、纤维素酶等酶类，使茶粕中的淀粉、纤维素物质部分降解生成葡萄糖，而且能分泌多种蛋白酶，使血粉粗蛋白部分降解生成可被菌种细胞直接利用的氮类物质，这就为微生物的生长繁殖同时提供了C源和N源，故本实验用米曲霉来初步筛选发酵培养基。

制作4种不同配方的茶粕培养基，杀菌后将米曲霉分别接种于这四种培养基上，然后在一定条件下进行发酵^[3]。茶粕培养基的4种不同配方：

Ⅰ.茶粕13.5克，血粉1.5克，KH₂PO₄0.1%，MgSO₄ 0.05％，水20毫升

Ⅱ.茶粕13.0克，血粉2.0克，KH₂PO₄0.1%，MgSO₄ 0.05％，水20毫升

Ⅲ.茶粕12.5克，血粉2.5克，KH₂PO₄0.1%，MgSO₄ 0.05％，水20毫升

Ⅳ.茶粕12.0克，血粉3.0克，KH₂PO₄0.1%，MgSO₄ 0.05％，水20毫升

250ml三角瓶分别装茶粕培养基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ各15g，将米曲霉以10％的接种量分别接种于4个不同配方的茶粕培养基，然后在室温下培养4day。发酵完后向250ml三角瓶内加入200ml蒸馏水，30℃恒温水浴浸提3hr，过滤得到滤液和滤渣，滤液用来测定水溶性粗蛋白含量^[4]，滤渣烘干后用来测定粗纤维含量^[5]。

3.2单菌种发酵法初步筛选培养条件

本实验的目的是利用茶粕和血粉来大量培养菌种细胞以获得菌体蛋白，由于酵母菌是高蛋白合成菌，能利用培养基中的营养成分合成自身菌体蛋白，因此选用3株酵母菌来初步筛选培养条件。由于菌体蛋白可近似认为与菌体干重成正比例，即菌体干重多，菌体蛋白也多，且菌体干重的测定方法比菌体蛋白的要方便的多，故实验时以菌体干重作为测试指标，其中能使茶粕发酵后获得最多菌体干重的培养条件即是酵母菌的适宜培养条件。

本实验按L₉（3⁴）正交设计，分别研究白地霉、产朊假丝酵母、热带假丝酵母在不同装料量、培养基配方、培养时间及接种量条件下对菌体干重的影响^[6-7]。

250ml三角瓶装茶粕培养基15g，加水20ml，杀菌后将各酵母菌以5％（10％，15％）的接种量接种于培养基Ⅱ号配方（Ⅲ号配方，Ⅳ号配方），在室温下培养3day（4day，5day）。

培养结束后向三角瓶内加入200ml蒸馏水，30℃恒温水浴浸提3hr，过滤，所得滤液用来测定菌体干重。将滤液全部移入离心管中于3000r/min离心分离10min，再将上清液和管底的沉淀物分离，并将此沉淀物用蒸馏水洗涤三次，收集到的即是菌体细胞。将菌体细胞置65℃烘箱中烘干至恒重，用电子天平称重^[8]。

4 结果与讨论

4.1 米曲霉初步筛选培养基结果

4种不同配方的茶粕培养基在接种米曲霉进行培养后，其水溶性粗蛋白及粗纤维含量如表1所示。

表1  米曲霉单菌种初步筛选配方实验结果

从表1可以看出，米曲霉在配方Ⅱ，Ⅲ ，Ⅳ中均可生长，且这三个培养基在发酵后可溶性粗蛋白含量都有一定的提高，粗纤维含量也都有一定的降低，说明这三种培养基的营养成分比较合理，能够使微生物正常的生长繁殖。由于配方Ⅰ的可溶性粗蛋白提高率较低，不利于原料充分利用，故应淘汰。

4.2单菌种发酵法初步筛选培养条件

4.2.1 白地霉适宜培养条件筛选

将白地霉接入茶粕培养基，然后在不同条件下进行培养，培养结束后测定培养基中菌种细胞的干重（即菌体干重），实验结果见表2及表3。

表2  培养条件正交实验的因素和水平

表3  白地霉适宜培养条件正交实验结果

从表3的极差分析结果可以看出，影响因子按从大到小的顺序为：B>  C>D>A，即培养基配方对菌体干重的影响最大，其次是接种量和培养时间，装料量对茶粕的水溶性蛋白含量影响最小；白地霉较优的培养条件是A₂B₂C₃D₁ 或A₁B₂C₂D₂。

4.2.2 产朊假丝酵母适宜培养条件筛选

将产朊假丝酵母接入茶粕培养基，然后在不同条件下进行培养，培养结束后测定培养基中菌种细胞的干重（即菌体干重），结果见表4及表5。

表4  培养条件正交实验的因素和水平

表5  产朊假丝酵母适宜培养条件正交实验结果

从表 5 的极差分析结果可以看出，影响因子按从大到小的顺序为B> C> A >D，即培养基配方对菌体干重的影响最大，其次是接种量，培养时间和装料量对菌体干重的影响最小，且两者对菌体干重的影响差别不大；产朊假丝酵母较优的培养条件是A₁B₃C₃D₃ 或A₁B₂C₂D₂。

4.2.3 热带假丝酵母适宜培养条件筛选

将热带假丝酵母接入茶粕培养基，然后在不同条件下进行培养，培养结束后测定培养基中菌种细胞的干重(即菌体干重)，结果见表6及表7。

表6 培养条件正交实验的因素和水平

表7  热带假丝酵母适宜培养条件正交实验结果

从表7 的极差分析结果可以看出，影响因子按从大到小的顺序为C>  B> A > D，即接种量对菌体干重的影响最大，其次是培养基配方，装料量和培养时间对菌体干重的影响差别不大；热带假丝酵母较优的培养条件是A₁B₂C₂D₂ 或A₁B₃C₃D₃或A₂B₂C₃D₁。

    根据表3、表5及表7的正交实验结果，可以看出对于3株酵母菌来说，培养条件A₁B₂C₂D₂对所选用的任一菌种来说都是比较适宜的，因此初步确定油茶饼粕制备SCP所用的培养条件为A₁B₂C₂D₂，即：装料量15g，培养基选用Ⅲ号配方，总接种量为10％，培养周期为4day。

5 结论

用米曲霉初步筛选茶粕培养基配方，经初步筛选，选用配方Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ作为筛选混合菌种用的培养基。用白地霉、产朊假丝酵母、热带假丝酵母初步筛选培养条件，确定筛选混合菌种用的培养条件为：培养基选用Ⅲ号配方，总接种量为10％，培养周期为4day。

参考文献

[1]魏瑶.单细胞蛋白.四川粮油科技,2003(4):41-44

[2]江绍安,夏晨.菌体蛋白粉在生长肥育猪日粮中的应用实验.广东饲料,2004,13(6):35-37

[3]贠建民,史琦云.马铃薯渣固体发酵生产菌体蛋白饲料的研究.微生物学杂志,1999,19(2):23-27

[4]无锡轻工业学院、天津轻工业学院合编.食品分析.轻工业出版社,1983

[5]大连轻工学院等编.食品分析.中国轻工业出版社,1994

[6]李巨秀,李志西,黄海瀛.苹果渣生产菌体蛋白饲料发酵条件的研究.西北农林科技大学学报(自然科学版),2003,31:79-81

[7]高再兴,等.微生物发酵果渣蛋白饲料－发酵工艺条件的研究.西北大学学报（自然科学版）,2003,33(6):701-704

[8]刘健,陈庆森．X．ampelinaTS206发酵制备冰核活性蛋白的研究[J]．生物技术,2000,12(6):33