可用于基因检测的啤酒发酵液DNA提取方法研究
2007-04-11 16:12:35   来源：食品科学   评论：0 点击：

        微生物污染对食品质量的影响是非常重要的。实现食品、尤其是发酵食品生产过程的微生物在线检测，是保证食品质量的关键。啤酒生产是建立在利用有益微生物的发酵和控制有害微生物的污染基础上，发酵过程中，污染微生物的各种代谢产物，多数能造成异味，即使污染菌死亡或被除去，异味仍然会留在啤酒中。污染微生物还能引起啤酒的混浊和沉淀，影响感官。某些污染菌分泌的多糖，使啤酒粘度提高，丧失爽口性。我国作为啤酒产量世界第一的国家，啤酒质量尤其是微生物管理的重要方面。目前，许多研究者都致力于将基因诊断技术应用于啤酒污染菌种的鉴定与检测研究[1-2]，其中，RAPD-PCR[3]、特异引物PCR[4]为快速检测啤酒腐败菌提供了方便、快捷的途径。微生物的基因诊断技术是通过分析样品中DNA分子的种类、数量等基因组信息来反映微生物细胞种类与种群比例等信息的。该技术摆脱了微生物培养的局限性，但如何得到具有代表性的DNA样品成为研究者关注的热点。啤酒发酵液中，除了啤酒酵母外，还可能有污染的细菌、非啤酒酵母等微生物，提取啤酒发酵液DNA的方法应同时适应于提取原核和真核微生物的DNA。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1啤酒发酵液山西月山啤酒有限公司。

1.1.2菌株DH5α(E.coli.)、YK-1R(Bacillus)、K氏酵母均为本室保存；啤酒酵母菌(S.cere)，细菌T均从啤酒发酵液中分离获得。

1.1.3培养基用麦芽汁培养基分离培养酵母菌，用营养琼脂培养基分离培养细菌。

1.1.4主要试剂酸洗玻璃珠    北京鼎国生物技术发展中心；氯化苄(phCH2Cl)原液    北京市兴津化工厂；溶菌酶和随机引物上海生工；Taq DNA聚合酶及PCR反应试剂、琼脂糖、dNTP等    Promega公司。

1.2方法

1.2.1DNA提取方法取发酵10d的啤酒发酵液1ml，4℃ 12000r/min离心3min，收集菌体；其它菌取培养16h菌液1ml，同样方法收集菌体。分别用玻璃珠法，溶菌酶法[5]，冻融法[6]，phCH2Cl法[7]提取DNA。玻璃珠法：0.5ml灭菌的高纯水(SDW)漂洗菌体一次，用200μl玻璃珠破菌缓冲液(20mmol/L Tris.Cl，10mmol/L MgCl2，1mmol/L EDTA，5%(V/V)甘油，0.3mol/L (NH)2SO4，pH7.9)重悬，加200μl(约0.3g)酸洗玻璃珠及200μl酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，高速振荡3min；加200μl TE缓冲液(10mmol/L Tris.Cl，1mmol/L EDTA，pH8.0)，快速振荡，高速离心5min；吸出上清液，加1ml冷的无水乙醇，颠倒混匀，室温下高速离心3min，弃上清；沉淀中加0.4ml TE缓冲液，30μl 1mg/ml RNA酶A ，混合，37℃温育5min；10μl 4mol/L的NH4Ac，1ml无水乙醇，颠倒混匀，室温下高速离心3min，弃上清；干燥沉淀；加100μl TE缓冲液；－20℃保存备用。

1.2.2DNA浓度测定和电泳检测DNA浓度测定用DyNA QuantTM200荧光仪(Hoefer)，同时用琼脂糖凝胶进行电泳检测，UVP-GDS8000凝胶成像系统记录结果。

1.2.3细胞裂解效率的计算分别用血球计数法和平板计数法获得酵母和细菌在裂解前后的数量，以裂解的细胞总量占裂解前细胞总量的百分数为裂解效率。

1.2.4RAPD-PCR扩增    方法同文献[8-9]。2结果与分析

2.1污染杂菌的分离无菌操作，取啤酒发酵液，稀释涂平板培养，分离到一种酵母菌和三种污染细菌(W,Y,T)。酵母菌经鉴定为生产用啤酒酵母(S.cere)；污染细菌均为G－细菌。

2.2不同DNA提取方法的裂解效率

准确分析啤酒发酵液中微生物的种类，依赖于提取DNA的质量、产量和多样性，而三者的获得是建立在对细胞完全裂解和DNA充分释放的基础上。不同的提取方法，细胞裂解程度各异。玻璃珠法裂解酵母菌效率在90%以上；溶菌酶法、冻融法对酵母菌的裂解效率不到30%，而对细菌的裂解却能达到99%以上；phCH2Cl法对酵母菌和细菌细胞的裂解效率均达到100%(见表1)。

2.3不同方法提取啤酒发酵液的DNA浓度

用玻璃珠法、溶菌酶法、冻融法和phCH2Cl法分别提取相同量的啤酒发酵液基因组DNA，溶于相同体积的高纯水中，测DNA浓度。结果显示，4种方法的提取效率不同，其中phCH2Cl法的提取效率最高(见表2)。

2.4啤酒发酵液DNA电泳图谱

4种不同方法提取的啤酒发酵液DNA经0.8%的琼脂糖凝胶电泳，检测结果表明除冻融法，其余3种方法得到的DNA均大于23kb、无拖尾、无蛋白污染。phCH2Cl法图谱更清晰，几乎没有降解(图1、2)。

2.5phCH2Cl法提取能力

分别取0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0ml啤酒发酵液，收集菌体，提取DNA(发酵液含湿菌量为0.03g/ml，所提DNA溶解于30μl无菌去离子水中)，然后测DNA浓度，电泳检测。浓度测定结果分别为3、57、108、169、323、390μg/ml，换算成每克湿菌体的DNA得率分别为6、57、72、85、108、98μg/g。当收集发酵液超过4.0ml，即菌量大于0.12g时，操作有困难。凝胶电泳结果见图3。另外也可固定提取的样品量，按比例降低试剂用量，以达到降低提取成本的目的。

2.6RAPD-PCR扩增啤酒发酵液DNA

由于啤酒发酵液的复杂性，提取的DNA是否可用于PCR扩增成为分子生物学方法在线检测发酵过程中微生物污染的重要前提。不同RAPD引物扩增啤酒发酵液DNA和同一引物分别扩增啤酒发酵液、酵母和细菌DNA的结果(图4、5)均说明，phCH2Cl法提取的基因组DNA可用于分子生物学研究。

3讨  论

原核细胞壁主要由肽聚糖构成，其每个肽聚糖单体含有由一个N-乙酰葡糖胺与一个N-乙酰胞壁酸分子通过β-1,4-糖苷键连接而成的双糖单位，溶菌酶能够打开β-1,4-糖苷键有效地水解细胞壁。而真核细胞壁中主要以几丁质构成其骨架结构，几丁质是以N-乙酰基葡萄糖胺为单体的聚合物，它的糖链上含有大量的羟基。氯化苄是一种可与多糖上的羟基作用生成醚的化学试剂，也可与细胞壁上的羟基反应并破坏细胞壁糖链。所以，溶菌酶法适合裂解细菌细胞，phCH2Cl法既适合裂解细菌细胞又适合裂解酵母细胞。我们的实验结果也证明了这一点。本文通过细胞裂解效率、提取的DNA浓度和DNA电泳图谱检测，对4种提取DNA方法进行综合评价，由于啤酒发酵过程中，原核生物和真核生物的污染都可能发生，因此，确定phCH2Cl法优于其它方法。本文还进一步对phCH2Cl法提取DNA的能力进行实验，并对其进行RAPD-PCR扩增，证明该方法提取的DNA可进一步用于啤酒发酵过程中微生物污染的分子检测。