法夫酵母产虾青素发酵促进剂的研究
2007-04-05 17:42:27   来源：江苏农业科学   评论：0 点击：

　　虾青素(astaxanthin)化学名称3,3′—二羟基—4,4′—二酮基—β,β′—胡萝卜素,又称虾黄质、虾黄素、龙虾壳色素,分子式为C40H52O4,是一种非维生素A源类胡萝卜素。虾青素不仅具有特殊的着色功能,使鱼类的肉质、虾壳和家禽的表皮及卵黄着色,使其色泽鲜艳[1-2],还具有高度淬灭单原子氧和清除自由基的作用,其抗脂肪氧化的能力比β-胡萝卜素高10倍,比维生素E高100倍,可有效防止组织、细胞和DNA被氧化[3];另外还具有增强免疫[4]、抗癌、保护心血管健康等生理功能[5]。虾青素作为功能性色素在医药、食品、饲料及化妆品等工业中具有广阔的应用前景。

法夫酵母是一种产虾青素的酵母,在其所产的类胡萝卜素中虾青素是主要成分,占类胡萝卜素总量的40%～95%[6],且法夫酵母生长速度快,发酵条件温和,色素易于提取,因而被认为是最有可能实现工业化发酵生产天然虾青素的优良菌种,深受国内外研究人员的关注。但由于原始分离的法夫酵母虾青素产量水平不高,要实现工业化生产必须设法提高产量。除了选育高产虾青素的突变株外,根据文献报道,针对不同的法夫酵母菌株,在培养基中添加乙醇、柠檬酸盐、甲羟戊酸、甘油、红糖、甲瓦龙酸、番茄汁、蒎烯、单萜类等均能提高法夫酵母中虾青素的含量[7-8]。但从工业化生产的角度考虑,应选价格低廉易得的物质。故在本试验中选用乙醇、柠檬酸盐、甘油、红糖等4种发酵促进剂,添加到培养基中,观察其是否能提高本实验室所筛选的法夫酵母中虾青素的含量。

1　材料与方法

1.1　菌种本实验室筛选保藏的法夫酵母(Phaffiarhodozyma)269,其虾青素含量占类胡萝卜素总量的78%。

1.2　培养基斜面培养基(g/L):葡萄糖10,酵母膏3,蛋白胨5,麦芽汁(10°Bx)3,琼脂20。种子培养基(g/L):葡萄糖10,酵母膏3,蛋白胨5,麦芽汁(10°Bx)3。发酵培养基(g/L):淀粉水解液,硫酸铵5,磷酸二氢钾2,玉米浆2,硫酸镁0.5,氯化钙0.1,pH值6.0。

1.3　方法

1.3.1　种子培养　从斜面上挑1环菌体于25ml种子培养基(250ml摇瓶)中,22℃、220r/min下旋转振荡培养48h。1.3.2　发酵培养　将培养48h的种子液按10%(V/V)的接种量接种到25ml发酵培养基中(250ml摇瓶),22℃、220r/min下旋转振荡培养72h。

1.3.3　菌体生物量的测定　取10ml发酵液于4000r/min下离心7min后,用蒸馏水洗涤离心3次,于105℃下烘干至恒重称重。

1.3.4　检测项目　类胡萝卜素总量的测定采用二甲亚砜(DMSO)法[6]:取2ml发酵液,离心后用去离子水洗涤离心3次,加2ml55℃的DMSO破壁,最后用5ml丙酮提取,在480nm下测其OD值,同时用2mlDMSO和5ml丙酮混匀调零。计算公式为:类胡萝卜素总量(μg/gCDW)=(A×Va)/(E×G)或类胡萝卜素总量(μg/ml)=(A×Va)/(E×Vb),其中A:吸光度;Va:提取液的体积;E:消光系数(0.16);G:发酵液的细胞干重(CDW);Vb:发酵液的体积。虾青素含量采用HPLC法[6]测定。发酵液残糖采用3,5—二硝基水杨酸比色法(DNS法)[9]测定。

2　结果与分析

2.1　4种不同发酵促进剂对法夫酵母发酵的影响

在原有培养基的基础上,分别添加一定量的乙醇、柠檬酸盐、甘油和红糖,添加浓度均设为0、0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、0.8%、1.1%和1.4%等8个梯度,按接种量10%,于22℃、220r/min下摇瓶发酵72h后测定虾青素含量和生物量,结果见表1～4。可以看出,在一定质量浓度下,乙醇、柠檬酸盐、甘油和红糖对虾青素的合成均有不同程度的促进作用。其中甘油、柠檬酸盐和红糖的添加量为0.5%、乙醇的添加量为0.1%时,虾青素含量达到最大值。随着添加量进一步提高,法夫酵母生物量和虾青素含量均有不同程度的降低。

2.2　4种发酵促进剂对法夫酵母发酵影响的比较从表5可以看出,在摇瓶发酵试验中,4种发酵促进剂均能不同程度地提高法夫酵母生物量和色素量,其中以添加0.5%的柠檬酸盐对虾青素含量提高率最大,达到36.2%,虾青素含量为1608μg/g干细胞。柠檬酸盐能增加法夫酵母中虾青素含量与柠檬酸盐作为类胡萝卜素合成所需的乙酰基单元有关[7,10]。甘油和红糖能增加色素含量的机理目前还不太清楚。

2.3　分批发酵验证试验根据摇瓶试验结果,柠檬酸盐对法夫酵母中色素含量提高的效果最好。在培养基中加入0.5%的柠檬酸盐,以不加柠檬酸盐为对照,培养基中其他成分不变,在22℃、搅拌转速400r/min、通气量为5L/min的条件下进行10L罐分批发酵试验(装液量为6L),结果见图1、图2。

由图1和图2可以看出,两种情况下虾青素含量和生物量达到最大值的时间均为72h,但最大值相差较大。在不加柠檬酸盐的10L罐分批发酵试验中,类胡萝卜素含量和生物量最大值分别为20.13μg/ml和18.0mg/ml;而在添加柠檬酸盐的情况下,类胡萝卜素含量和生物量最大值分别为32.1μg/ml和25.9mg/ml,分别提高了59.5%和43.9%,色素量达1310μg/g干细胞。这进一步证明了柠檬酸盐能提高法夫酵母269菌株虾青素的含量。但随着发酵时间的进一步延长,类胡萝卜素含量和生物量均下降,可能是由细胞自溶造成的。

通过对4种法夫酵母发酵促进剂的研究,得出乙醇、柠檬酸盐、红糖和甘油均能不同程度地提高269菌株虾青素的含量。其中以添加0.5%的柠檬酸盐对法夫酵母摇瓶发酵的虾青素产量提高率最大,达到36.2%,其色素量也最大,为1608μg/g干细胞。10L罐分批发酵验证试验结果表明,添加0.5%的柠檬酸盐使法夫酵母产色素量提高了59.5%,进一步证明柠檬酸盐对法夫酵母269菌株发酵具有促进作用。