一步法发酵菊芋生产乙醇
2009-06-17 21:31:19   来源：本站原创   评论：0 点击：

 
利用非粮作物生产燃料乙醇，是我国燃料乙醇产业发展的基本方向。菊芋的主要成分菊粉是多聚果糖，可以通过酸解和酶解等途径转化为易于发酵的果糖。在国家海洋863项目的支持下，我国在耐盐菊芋品种选育及滩涂示范种植方面已经取得突破，菊芋的干基生物质产量和成本，与当前燃料乙醇生产使用的粮食类淀粉质原料相比，具有竞争优势，将是我国燃料乙醇产业规模化发展可选择的原料之一。

国内外学者先后报道了各种以菊粉为原料生产乙醇的工艺技术，包括首先酸解或用黑曲霉等微生物产生的酶水解菊粉中的糖，再利用酿酒酵母发酵生成乙醇，或者进行菊粉酶产生酵母与酿酒酵母的混合培养。与这些工艺相比，利用克鲁维酵母产生的菊粉酶和其乙醇发酵特性直接发酵菊粉生成乙醇的一步法工艺，不仅省去了菊粉酶解步骤，降低了过程成本，而且同步糖化发酵可以防止因菊粉降解物糖的积累而抑制菊粉酶生成及乙醇发酵的现象，有利于维持较高的乙醇生产强度，从而具有良好的工业化应用前景。

本研究使用具有菊粉酶生产能力且乙醇发酵性能优良的马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus YX0l，首先以菊粉为底物，考察了这一集产酶、糖化和乙醇发酵为一体的一步法乙醇发酵新工艺，进而以近海滩涂种植海水灌溉收获的菊芋为原料，直接发酵生产乙醇。取得的研究结果可以为菊芋燃料乙醇技术的中试放大提供指导。

1材料和方法

1．1材料

1．1．1菌种

本实验室驯化保存的马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus YXO 1。

1．1．2  菊芋材料

生长于山东莱州湾并使用25％海水灌溉的菊芋由南京农业大学刘兆普教授提供。

菊粉(菊芋的热水抽提物)购于内蒙古亿利生物技术有限公司，经实验测定100g菊粉水解可得到90g还原糖。

1．1．3培养基

    (1)种子培养基(g／L)：菊粉40，酵母粉4，蛋白胨4，玉米浆10，121℃灭菌15 min；

    (2)发酵培养基(g／L)：菊粉200，酵母粉4，蛋白胨4，pH 4．6，115℃下灭菌15 min。

    (3)粗菊芋粉发酵培养基：60目以下的粗菊芋粉配成的培养基，浓度分别为：250 g／L、225 g／L、200 g／L。

1．2实验方法

1．2．1  种子液的培养方法

    YX01接种种子培养基后，在38℃条件下培养24 h，其OD达到10左右，菊粉酶活力3 u／mL。

1．2．2  最适发酵温度的确定

    发酵培养基95 mL中分别接入YX01种子液5 mL，加上厌氧塞，150 r／min，30℃、32℃、35℃、38℃、41℃摇床中进行乙醇厌氧发酵。分别于12 h、24 h、36 h、48 h取样测其生物量、总糖、菊粉酶酶活、乙醇，选定其最适发酵温度。

1．2．3  最适通气量的确定

发酵罐(KF-2．5L，韩国)中盛装900 mL发酵培养基，分别接入种子液100 mL。分别在厌氧和通气量50 mL／min和100 mL／min条件下进行批式发酵实验。pH控制在4．6-4．7，温度35℃，转速300 r／min，考察通气量对产菊粉酶和乙醇的影响。

1．2．4  底物浓度对发酵的影响

 发酵罐(KF-2．5L，韩国)中盛装900 mL发酵培养基，分别种子液100 mL。分别在不同底物浓度条件下进行批式发酵实验。pH控制在4．6-4．7，温度35℃，转速300 r／min，考察底物浓度对发酵的影响。

1．2．5  不同底物浓度的25％海水灌溉菊芋粉对发酵的影响

 以60目筛分的25％海水灌溉的干燥粗菊芋粉不经灭菌直接作为底物进行厌氧发酵，pH控制在4．6±0．2，温度35。c，转速300 r／min,，接种量为10％。参照目前淀粉质原料乙醇发酵底物浓度要求，选取菊粉浓度为250 g／L、225 g／L、200 g／L。

1．2．6  海水灌溉菊芋批式补料发酵    以60目筛分的25％海水灌溉的粗菊芋粉为底物进行厌氧发酵，pH控制在4．6±0．2，温度35℃，转速300 r／min，接种量为10％。参照目前淀粉质原料乙醇发酵底物浓度要求，配制起始菊粉浓度为180 g／L，培养24 h后添加菊芋粉100 g。

1．3分析方法

    (1)总糖和还原糖的浓度：总糖使用浓盐酸水解后，用3,5一二硝基水杨酸(DNS)法测定还原糖。

    (2)菊粉酶活的测定方法：将培养液离心分离，上清液作为粗酶液，取适当稀释的酶液0．5 mL，加人2％的菊粉溶液0．5 mL，按照文献方法测定酶活。

    菊粉酶活性单位定义：反应体系中每分钟产生1μmol己糖所需酶量为1个酶活单位。

    (3)乙醇浓度由Agilent 6890气相色谱仪内标法测定.

    (4)酵母浓度的测定采用干重法或比浊法，具体方法如下：干重法：取一定体积的样品置于预先烘干称重的离心管中，离心后的沉淀用蒸馏水洗涤2次，然后置105。c的恒温烘箱中烘至恒重后称重；比浊法：所得发酵液制得菌悬液后，稀释10倍，在OD600下测光密度值。

2结果与讨论

2．1适宜发酵温度的确定

  前期摇瓶培养结果显示，YX01是很好的耐热菌株，温度高达38。c不影响其生长，而且有利于产酶(数据待发表)，因此确定38℃为YX01生长和产酶温度。由图l所示，不同温度的发酵过程中，总糖逐步降低，但30℃时降糖速度明显低于32℃和35℃；在发酵过程中，菊粉酶酶活基本保持不变，且各温度问差距不大；而生物量随温度的升高而降低。在发酵终点48 h时，35℃下的乙醇浓度明显高于其他温度。根据以上实验数据可以确定35℃为YX01的最适发酵温度。

2．2通气量对发酵的影响

在克鲁维酵母同步糖化发酵菊芋的过程中，通气量是很关键的参数。菊粉酶的分泌是好氧过程，而乙醇发酵是在厌氧条件下进行的。如何控制通气量成为整个发酵过程能够实现优化的关键。由图2可见，随通气量的增大，糖醇转化率呈现降低的趋势，分别为83％、70％和51．4％。通气条件下，总糖的降解速率稍高于厌氧条件，菊粉酶酶活在培养后期开始增加，而厌氧条件下的酶活力基本保持不变，说明在同步糖化发酵中，种子液中的菊粉酶已经能够满足后续糖化过程的需要，无需通气刺激产酶，所以后续发酵实验采用厌氧条件。

2．3底物浓度对发酵的影响

底物浓度对YX01乙醇发酵过程的影响如图3所示(以235 g／L的菊粉浓度为例)，200 g／L、222 g／L和235 g／L三种菊粉浓度条件下，表现出相同的规律。发酵进行到24 h时，有大量还原糖积累，从总糖与还原糖的差值看出，只有少部分菊粉没有被水解，表明在乙醇发酵条件下，菊粉酶的糖化能力仍然很强。24 h以后还原糖以几乎恒定的速率减少，乙醇则以同样规律增加，进入主发酵阶段。

表1给出了不同底物浓度条件下，发酵终点的生物量、乙醇、残总糖、残还原糖浓度及乙醇得率。可见，在200 g／L、222 g／L和235 g／L二三种底物浓度条件下，乙醇得率均达0．42以上。尤其在初始底物浓度为235 g／L条件下，发酵终点乙醇浓度为92．2 g／L(11．5％，V/V)，乙醇得率为0．44，糖醇转化率为86％，基本上满足乙醇发酵工业生产的要求。

2．4菊芋粉的发酵研究

    实验中使用的商品菊粉为菊芋粉的热水抽体物，成本较高，显然不能用于大规模生产，并且由于菊芋鲜果不耐贮藏，一般在收获季节可以直接加工，以降低成本，不能及时加工的鲜果，宜干燥处理后贮藏，为此考察了菊芋干粉乙醇发酵效果。

    以60目筛分的25％海水灌溉的粗菊芋干粉(水分含量6％-7％，果糖含量75％±2％)为底物进行厌氧发酵过程中的总糖、果糖和乙醇时程变化如图4所示。从实验结果可以看出：底物浓度虽然不同，但果糖和总糖的降低速度相差不大，且果糖最终浓度相近；但残总糖的浓度和底物浓度直接相关，底物浓度高，残糖也相应提高。不同底物浓度发酵条件

下，菊粉酶酶活相差不大。乙醇浓度随底物浓度的增加而增加，菊芋干粉浓度为250 g／L时，乙醇浓度达到66．9g／L，但糖醇转化率有所降低，从200g／L底物浓度的80％降低到70％。由于本研究的一步法发酵利用自产菊粉酶边糖化边发酵，原料不需蒸煮和预先糖化，因而节约了大量的能耗和额外添加酶的费用，同时还减少了因蒸煮而造成的可发酵性糖的损失，边产酶边糖化使发酵醪中单糖的含量始终保持在较低的水平，避免了因底物积累造成的抑制现象。此外，发酵过程也比较平稳，发酵温度较容易控制。如果这一工艺未来应用于工业化生产，在工厂建设中就可以省去蒸煮设备、糖化设备以及有关的附属配套设备，大大节省了基建和设备投资，必然也节省了由此引起的动力、用水、人工、维修等方面的消耗，相应降低了生产成本。另一方面，我们也注意到此实验中的乙醇终点浓度略低于目前乙醇行业水平，主要是因为底物浓度加大后，醪液黏度增大，流动混合困难，需要在后续的中试放大乃至生产中解决。

2．5菊芋粉的批式补料发酵研究

    为进一步提高菊芋粉发酵的终点乙醇浓度，进行了菊芋干粉的批式补料发酵实验，使底物总浓度达到280 g／L，实验结果如图5所示。实验中观察到，通过这种批式补料方式，可以避免一次性投料发酵醪黏度太高的现象，发酵终点乙醇浓度提高到84 g／L，

乙醇得率为0．404，达到理论转化值的80％左右。目前这种批式补料发酵的中试试验正在进行。

3  结论

    (1)通过测定生物量，菊粉酶活力和乙醇浓度确定了发酵菊芋产乙醇的马克斯克鲁维酵母YX01最适发酵温度35℃；通气量实验证明该菌株一步法发酵菊粉时无需通气供氧。

    (2)在菊粉浓度235 g／L时，YX01发酵的最高乙醇浓度为92．2 g／L，乙醇得率为0．436，为理论值的85．5％。

    (3)200 g／L的25％海水灌溉的菊芋干粉在未添加任何营养物质，未经灭菌处理条件下，YX01边产酶、边糖化、边发酵，乙醇终浓度达到为61．0 g／L，乙醇得率为0．407，达到理论转化值的80．0％。

    (4)以25％海水灌溉的菊芋干粉为底物进行批式补料发酵，280 g／L未灭菌的干粉发酵产乙醇终浓度为84 g／L，乙醇得率为0．404，达到理论转化值的80％左右。

生物工程学报2008年第24卷11期

袁文杰，任剑刚，赵心清，白凤武

大连理工大学生物科学与工程系，大连116023