紫外分光光度法测定发酵液中的2-苯乙醇含量
2007-10-16 23:20:28   来源：食品与发酵工业   评论：0 点击：

　　2-苯乙醇(2-phenylethanol,PEA)是一种具有淡雅细腻玫瑰气味的芳香醇,广泛应用在食品、药品和日化用品等众多领域中。目前,2-苯乙醇主要是用廉价的化工原料有机合成生产,存在诸如产品纯度低、合成过程污染大等弊端[1]。随着生物技术的飞速发展,利用微生物转化法生产2-苯乙醇具有极大的可行性。微生物转化法生产2-苯乙醇,就是以L-苯丙氨酸为前体,由酵母菌发酵转化为2-苯乙醇,此法生产的2-苯乙醇,产品具有“天然”属性,气味纯正,以及生产过程污染小等优点。
样品的快速准确测定,对工艺开发进程有着重要的推动作用。目前,国内外文献报道的2-苯乙醇测定方法有气相色谱法和液相色谱法,这2种方法虽然具有灵敏度和准确性高的优点,但对于大批样品的分析,存在速度慢,成本高等缺点,特别是对于2-苯乙醇转化合成的菌种选育工作。紫外分光光度法分析具有灵敏度高、精密度好、操作简单、应用范围广等优点。如能利用紫外分光光度法测定发酵样品中的2-苯乙醇,将给生物转化法生产2-苯乙醇的工艺开发带来极大的便利。
1材料与方法
1·1　试　剂
2-苯乙醇,上海双香助剂厂,纯度98·0%;L-苯丙氨酸,浙江康普达生物科技有限公司,纯度99·5%;其他试剂均为AR级或BR级商品试剂。
1·2　主要仪器
主要仪器有气相色谱仪(上海精密科学仪器有限公司,GC112A);紫外可见分光光度计(日本岛津公司,UV-2450);电子天平(德国赛多利斯公司,BS210S);高速离心机。
1·3　PEA的测定
1·3·1　气相色谱法
取含菌体的发酵液10mL于离心管中,4000r/min离心20min后,取一定量的上清液于具塞刻度试管中(移取量视样品中PEA浓度而定),再加入0·1mL的2·0%苯甲醇作内标物,用蒸馏水定容到10mL,振荡混匀,进行气相分析。气相色谱柱为PEG20M(30m×0·53mm×1·0nm),FID检测器,载体为N2,具体分析方法参见文献[2]。
1·3·2　紫外分光光度法
取PEA的标准品溶液或转化发酵液样品离心上清液0·5mL于试管中,加入5·0mL的有机溶剂(正己烷、正庚烷或正辛烷),充分振荡后静置30min,上层含PEA的有机溶剂萃取液直接进行紫外分光光度法测定,以蒸馏水进行同样操作的上层有机溶剂为空白参比。
2　结果与分析
2·1　萃取溶剂的选择
实验要求有机溶剂对PEA有较好的溶解性,萃取时处于上层,且无紫外吸收。正烷烃符合这些要求,实验对正己烷、正庚烷和正辛烷进行了三者选一的实验。在试管中加入浓度为5·0g/L的PEA溶液0·5mL,再分别加入5·0mL的正己烷、正庚烷和正辛烷,充分振荡后静置30min,用气相色谱测定水相和有机溶剂相中PEA的浓度,结果见表1。

 
　　由表1可见,3种正烷烃能较好地将水相中的PEA萃取出来。正己烷为萃取溶剂时,PEA的回收率最高,但考虑到正己烷的沸点为68·95℃,在室温下易挥发,萃取后的样品如不及时测定,挥发将导致样品浓缩,影响测定结果的稳定性。正庚烷的沸点98~99℃,挥发性较小,所以选择正庚烷作为测定PEA的萃取溶剂。
2·2　测定波长的选择
文献报道的PEA液相色谱分析,选择216nm或254nm作为检测波长[3,4],其依据是PEA在这2个波长处有紫外吸收峰,至于哪1个吸收峰适合紫外分光光度法测定,实验对标准品和发酵液的正庚烷萃取液于200~300nm处进行全波长的扫描,扫描图谱见图1。

　　由图1可见,以正庚烷为溶剂,PEA在216nm和258nm处的有2个紫外吸收峰。发酵样品的正庚烷萃取液,无其他有紫外吸收的干扰物存在。由图1还可以看出,PEA标准品和发酵样品浓度不同,在258nm处的吸光度差别明显,但在216nm处则没有差别;一般的紫外分光光度计在258nm测定时,仪器状态较216nm稳定,所以选择258nm波长作为PEA紫外分光光度法测定的波长。
2·3　标准曲线的制备
配制标准品PEA浓度为1·0~8·0g/L水溶液,制备正庚烷的PEA萃取液,于波长258nm处测定其吸光度,以PEA浓度(C,g/L)为横坐标,A258为纵坐标,绘制的标准曲线见图2。
　　由图2可知,PEA浓度在1·0~8·0g/L范围内,与A258的线性关系良好,得到回归方程A=0·0941C+0·0197,R2=0·9991,检出限为0·19g/L,由标准曲线的斜率可以看出该方法的灵敏度不高,但能满足实验测定的需要。由标准曲线的回归方程直接算

出待测样品中PEA的浓度。
2·4　重复性实验
取一PEA转化发酵液样品,经4000r/min的转速离心20min后得无菌体的发酵液样品,然后按2·3用正庚烷进行萃取,测其A258,并由标准曲线计算出发酵液中的PEA浓度。重复5次,计算得RSD为1·66%,结果见表2。

2·5　回收率实验
　　取已知PEA浓度的发酵样品4份,分别添加PEA标准品溶液,使样品中的PEA的添加浓度分别为1·0、2·0、3·0、4·0g/L,紫外分光光度法测定样品中PEA的总浓度,计算回收率和RSD,两者分别为100·4%和1·32%,结果见表3。

2·6　发酵样品测定
取一批PEA发酵实验样品,分别进行气相色谱和紫外分光光度法分析,其中5个样品的测定结果见表4。
　　对2种分析方法测定的结果进行t检验,P=0·8119(>0·05),说明2种方法测定结果无显著性差异,紫外分光光度法测定发酵液中的PEA含量具有较好的准确性。

3　讨　论
由实验得到的数据可以看出,采用紫外分光光度法测定发酵液中的PEA,最大特点是操作方便快捷,同时也具有较高的精密度和准确性。虽然测定的检出限和灵敏度不高,但能够满足生物转化法生产PEA研究中的菌种筛选、发酵工艺优化等实验测定的需要。