溶氧及pH对地衣芽孢杆菌合成聚γ 谷氨酸的影响
2007-04-08 08:24:06   来源:应用与环境生物学报   评论:0 点击:

  多聚γ 谷氨酸〔γ poly(glutamicacid),γ PGA〕是由某些杆菌(Bacillusspp.)合成的一种细胞外水溶性高分子氨基酸聚合物,是由L 谷氨酸、D 谷氨酸两种构型的单体通过γ 酰胺键聚合形成的[1].γ PGA具有极佳的成膜性、成纤维性、阻氧性、可塑性、粘结性、保湿性和可生物降解等许多独特的理化和生物学特性,无毒无害,对人体无任何副作用[2~3].因此,γ PGA可以被广泛用于医药制造,食品加工,蔬菜、水果、海产品防冻、保鲜,化妆品工业,烟草、皮革制造工业和植物种子保护等许多领域,是一种有极大开发价值和前景的多功能新型生物制品[4~6].国外如日本、美国等国家自20世纪90年代初开展了一些利用摇瓶培养合成γ PGA的研究[5~7],主要工作集中于菌种生产性能的改良和营养条件的优化上,有关环境条件的影响很少报道,而这恰恰又是关系到γ PGA发酵生产能否成功进行的重要因素之一,国内还未见文献报道.作者在前期研究中,系统考察了营养条件对地衣芽孢杆菌分批发酵生产γ PGA过程的影响,提出并运用双底物控制策略提高了γ PGA产量.在此基础上,本文以地衣芽孢杆菌为研究对象,对影响γ PGA合成的溶氧、pH和甘油流加等发酵条件进行了研究.

1 材料和方法

1.1 菌种地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)QBL 033,为本实验室选育的菌株.

1.2 培养基斜面、种子及发酵培养基:见文献[5].

1.3 种子培养斜面种子活化6h后接入种子培养基中.37℃下培养20h,摇床转速200r/min.

1.4 发酵罐培养3.7L全自动控制发酵罐(KLF 2000,瑞士比欧)中装液量2.5L,接种量10%,温度37℃,通气量4L/min,培养时间46h.pH通过自动流加2mol/LHCl和2mol/LNaOH溶液进行调节.甘油耗尽后,饥饿0.5h开始流加50%(φ)甘油溶液.

1.5 生物量的测定测定540nm光密度和使用干重法.

1.6 γ PGA的测定采用Atsuo等[5]法.

1.7 葡萄糖测定3,5-二硝基水杨酸法测定.

2.1 搅拌转速对γ PGA分批发酵的影响溶氧是好氧微生物生长必需的营养物质之一,更是影响其进行物质生产和能量代谢的关键环境因素之一,在发酵过程中受通气量和搅拌转速以及发酵液性质等诸多因素的限制.通常在空气流量一定的情况下,搅拌转速的变化直接影响氧在发酵液中的传质效率,进而影响正常的细胞生长和代谢产物的形成.对于该菌来说,由于细胞生长受剪切的影响相对较小,因此可以通过变化搅拌转速来研究溶氧对发酵过程的影响.图1显示在不同搅拌转速下分批发酵生产γ PGA过程中溶氧的变化趋势,可见细胞在进入对数生长期(6h)之后对溶氧的需求明显增加.当搅拌转速低于250r/min时,供氧速率不能满足细胞快速生长的需要,出现了明显的溶氧下降现象;而当搅拌转

速高于300r/min时,供氧速率完全可以满足细胞正常生长代谢对氧的需求,因此溶氧一直保持在较高的水平.搅拌转速对γ PGA发酵过程的具体影响如表1所示.可以看出,溶氧供给的不足会对细胞生长有负面影响:搅拌转速为200r/min时的细胞干重比300r/min时低20%,γ PGA产量也相应降低.但是,由不同搅拌转速导致的不同溶氧水平对胞内γ PGA含量(反映细胞合成γ PGA的能力)并没有显著影响.由此表明,在B.licheniformisQBL 033发酵生产γ PGA的过程中,只要将溶氧水平控制在不限制细胞生长的水平之上(如50%~60%),就能够获得较高的γ PGA产量.进一步提高搅拌转速,虽然可以提供更为充足的溶氧,但这样一方面增加了动力消耗,另一方面也提高了体系的剪切应力,对细胞生长不利(搅拌转速从300r/min提高到350r/min会导致细胞干重减少8%).因此,在初始葡萄糖浓度为27.9g/L的情况下,将搅拌转速恒定在300r/min适于发酵生产,此时的溶氧传质状态可以作为对γ PGA发酵生产进行比拟放大的重要依据.

2.2 pH对γ PGA分批发酵的影响

2.2.1 不控制pH的γ PGA发酵过程  在研究确定了最适的温度控制和溶氧条件之后,着重研究了不同pH对γ PGA分批发酵的影响.图2 A~C)给出了不控制pH条件下,B.li cheniformisQBL 033分批发酵生产γ PGA的过程曲线.可见,随着底物的消耗,发酵液pH从6.0迅速下降至20h葡萄糖利用,完毕时,pH降至最低点1.31,之后基本上维持在该水平.发酵液逐渐增强的酸性对细胞生长有一定的抑制作用,直至20h时细胞量达最高值11g/L.实验观察到,在发酵前12h内,细胞合成的γ PGA基本都分布在胞内;但是12h后(此时pH低于1.6),γ PGA在胞外积累,且积累量不断增加,至20h达到最大值8.6g/L(图2 B).与此同时,胞内γ PGA含量很快由1.37%下降到0.56%(图2 C).细胞停止生长后,胞外γ PGA总量相对稳定,但胞内γ PGA总量仍在增加(图2 B),表明胞内γ PGA仍在继续合成.在整个发酵过程中,γ PGA的总量一直增加,至发酵结束时总γ PGA产量达到16.5g/L.自然pH条件下发酵液pH迅速下降,一方面是因为氮源硫酸铵为生理酸性盐;另一方面,葡萄糖被利用后生成了丙酮酸、α 酮戊二酸、乙酸等酸性中间代谢产物.当细胞处于较强的酸性环境时,胞外出现γ PGA的积累,可能是因为细胞在较低pH下产生应激机制导致细胞膜渗透性的改变,从而使胞内物质发生泄漏.这种泄漏不是由于细胞自溶引起的.因为即使在这样的酸性条件下,细胞仍然能够继续生长直至营养物质消耗完毕;再者,细胞停止生长后胞内仍然继续合成γ PGA,而胞外的γ PGA积累量并末增加.对γ PGA泄漏期间细胞形态的显微观察也表明,此时的细胞并未发生自溶.

γ PGA虽然属于胞内、外产物,通常用来维持胞内正常的氧化还原环境,因此向胞外分泌的量较少.如果γ PGA能够在胞外大量积累,可降低下游分离纯化的难度.向发酵液中添加丙酮醛、表面活性剂和抑制γ 谷氨酰转肽酶活性都是非常有效的办法,但至今并未见到有关在低pH下γ PGA可以向胞外发生泄漏的报道.至于其机理还有待进一步研究.

2.2.2 控制恒定pH时的γ PGA发酵过程  在不控制pH的条件下,虽然γ PGA可在胞外积累,但γ PGA总量较低.为此,作者研究了将发酵过程pH值控制在不同水平(pH4.0~6.5)对γ PGA分批发酵的影响,其中pH6.0下的γ PGA发酵过程曲线如图2 D~F)所示,与不控制pH的结果相比,细胞干?z重和γ PGA产量分别高出26%和94%.另外,在恒定pH条件下,细胞在生长阶段所合成γ PGA的基本上都集中细胞内,胞外检测不到γ PGA存在,只有到细胞生长结束后才有极少的γ PGA积累在胞外;至发酵结束时,pH6.0下的胞内γ PGA含量更是高出2倍以上.

2.3 单一碳源补料发酵过程中采用单一碳源,菌体生长和γ PGA都有所提高,菌体浓度达到19g/L,γ PGA42g/L,如图3所示.分泌阶段甘油流加速率由2.5mL/h逐渐增加到10mL/h,茵体平均比生长速率为0.01h-1,γ PGA的平均比生产速率为0.007gg-1h-1,菌体关于甘油的表观得率为0.64g/g.

2.4 甘油限制性流加的重要性采用不同甘油流加速率的数批发酵实验结果表明,平均比生长速率达到0.012h-1时,γ PGA的平均比生产速率可达0.02mgg-1h-1;比生长速过高或过低,γ PGA的比生产速率都较低.图3中36hγ PGA浓度的下降就是因为28h至44h之间菌体的比生长速率过低,γ PGA的降解速率高于生产速率造成的.发酵36h采用甘油单一碳源补料策略时,图3表明γ PGA出现二次合成高峰.实验表明,甘油的流加速率较低时,菌体的生长和γ PGA的产量较低,发酵时间较长;甘油的流加速率过高时,菌体的生长较快,可能发生氧限制,残余在发酵液中的甘油会产生阻遏作用,影响γ PGA的合成.此外,过量甘油会导致溢流代谢物乙醇产生,阻遏作用加强.由此可见,甘油的流加对γ PGA的合成分泌是至关重要的.

2.5 实现甘油限制性流加后的发酵过程采用溶氧水平2.3VVM作为甘油利用的指针后,甘油实现了限制性流加,即在维持一定的生长速率下,发酵液中无残余甘油,避免了溢流代谢产生乙醇,不会阻遏γ PGA的合成.如图4,发酵36h采用以溶氧为指针的甘油限制性流加,维持0.013h-1的平均比生长速率,最终菌体达到24.6g/L,γ PGA产量达到47g/L,γ PGA的平均比生产速率为0.02gg-1h-1.甘油关于菌体的表观得率为0.71g/g,比没有采用甘油限制性流加时都有所增加,这表明采用甘油限制性流加可以减少溢流代谢的流量,提高碳源的利用率.

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