10-HDA 微生物菌株的选育
2006-09-17 17:07:32   来源：不详   评论：0 点击：

     10-羟基-2-癸烯酸（10-Hydroxy-2-Decenoic 酸，10-HDA），分子量 186.25，白色晶体，熔点 64℃，溶于甲醇、乙醇、乙醚、和氯仿，微溶于丙酮，不溶于水，对石蕊试纸显酸性，能使溴水迅速退色，也能使高锰酸钾溶液迅速退色，对三氯化铁不显紫色，是一种天然的不饱和脂肪酸，是蜂皇浆的主要活性成份之一，又称蜂王酸或皇浆酸，10-羟基-2-癸烯酸的分子式是：HO-CH2-(CH2)6-CH=CH-COOH(C10H18O3)[1]
     10-HDA 是蜂王浆中含有的特殊活性物质，是评价蜂王浆质量的重要指标，具有抗菌、灭菌[2]、强壮肌体和具有强烈抑制移植性 AKR 白血病、TA3 乳腺癌及多种腹水型艾利虚癌等癌细胞生长的作用[3-4]。研究表明 10-HDA 具有免疫调节[5]和抗肿瘤的作用、可促进小鼠 T 淋巴细胞（Tlymphocycte 子集）、脾白介素 2（Interleukin-2）的增加[6]和肿瘤坏死因子（Tumor坏死因素）的产生[7]，还能防止脱发[7]，治疗急性辐射损伤[8]和化学物质所致损伤[9]，以及用作化妆品的增效剂，防止衰老，刺激表皮再生和更新，同时对血管紧缩素转化酶具有抑制活动，10-HDA 与百里醌或者含有百里醌的植物产物结合用来治疗艾滋病和其它的免疫缺乏疾病药物已经被发明[10]。遗传毒理学和药理学研究结果表明，10-HDA 能促进骨髓细胞分裂，促进人体外周血淋巴细胞脱氧核糖核酸合成，促进被 PHA激活的淋巴细胞的转化作用，增强免疫力。
      鉴于 10-HDA 的医疗效果及在自然界中仅为蜂王浆所特有的特点，10-HDA 含量一直为衡量蜂王浆内在质量及进出口的主要指标。目前生产 10-HDA 主要有两条途径，一条是物理提取法，另一条是化学合成法，物理提取法是从废弃的王浆残渣和变质的蜂王浆中提取，应用提取法生产 10-HDA，操作简单，但因10-HDA 在皇浆中的含量较少，况且变质废弃的蜂王浆毕竟数量不多，因此不适宜于大规模工业生产，而且还需要大量有机溶剂，成本较高。而化学合成法，合成条件苛刻，工艺流程复杂不易行。
      由于 10-HDA 具有巨大医疗和经济效益，以及其提取、化学合成方法的困难性，我们能看到采用微生物方法生产 10-HAD 是非常有必要的。
1 材料与方法
1.1 材料
      麦芽汁培养基、土豆培养基、蛋白东培养基、α-酚硫酸、硅胶 G 等。
1.2 仪器
      RE-52A 旋转蒸发仪，SHB-111 循环水真空泵，GCMS-QP2010 气质连用仪，LC-10Atvp 岛津高效液相色谱仪，LD-ZX-40BⅠ型立式自动蒸汽灭菌锅，低速离心机，HZ-9310K 振荡摇床，标准型净化工作台，303 电热培养箱。
1.3 菌种筛选步骤
    (1)取定量的原材料在无菌状态下粉碎，使其悬浮在盛有 100mL 无菌水的三角瓶中，充分混匀 10min后，用移液器取出菌液，然后再用无菌水进行梯度稀释从 10-1到 10-9，取后三个稀释度，用移液器吸 0.2mL稀释液,加入到标记好的分别盛有麦芽汁培养基、土豆培养基和蛋白胨培养基的有盖培养皿中，用无菌刮刀均匀涂抹，在 30℃培养 48-60h，直到菌体形成一个明显的区域。
   (2)观察菌体宏观形态，取少许在平板中形成的单菌落，然后在三种培养基平板上进行划线分离，30℃下培养 48-60h 后，将平板放入冰箱保存。
   (3)从保存的平板中取一环菌体分别装有 100mL液体麦芽汁培养基、土豆培养基和蛋白胨培养基中的500mL 三角瓶中，30℃、200rpm 下培养 18h。然后将5%的接种量接入 500mL 三角瓶中，三角瓶中的培养液体积为100ml，每一培养基做四瓶，在30℃、200r/min的条件下培养 24h、48h、60h、70h。用滴管取一滴发酵液，镜检观察，若有不纯菌体，继续进行纯化。
    (4)将发酵不同时间的培养液取出， 5000r/min 离心 20min，取上清液，洗涤菌体 1-2 次，在上清液中加同体积的乙醚或者氯仿（较少用、毒性大）充分振荡 20min，然后静置 30min，置于分液漏斗中再次静置 20min，分液，将乙醚层置于旋转蒸发仪，40℃旋转蒸发，除去乙醚，用 2-5ml95%的乙醇溶解剩余物，于小试剂瓶中低温保存，待检。用上述方法处理发酵液，进行薄层分析，流动相为丁酮：冰乙酸：水=6：1.5：3，用 α-酚硫酸显色后，与标准样相比较，取出与标准样 Rf 值相同或相近的原始菌种进行冷冻保藏。
    (5)经过初筛，复筛，分离纯化后筛选出三株比较有潜力的菌种，菌种初步确定为真菌，将获得的三株菌，进行扩大培养，发酵液提取处理后，再利用高相液相色谱和气质连用，进一步进行分析鉴定，首先确定出一株菌种 QYF005，如图 1、图 2。

   
2 结果与讨论
2.1 高压液相色谱分析
     实验仪器和分析条件：采用岛津—高效液相色谱仪外标法测定，LC-10Atvp 高压泵；SPD- 10Atvp 紫外检测器；phenomenex Luna 5u C18柱(150×4.6mm)；流动相 甲醇：水＝50：50（1000mL流动相中加入3.5ml盐酸）；柱箱温度 33℃；检测波长 208nm；进样速度1mL/min。
     将所培养菌的发酵液进行前处理后浓缩，0.45μm滤膜过滤，取定量（一般 10μl）进样，将色谱峰于在同样条件下的，纯品峰进行比较，色谱图如图 3、图 4表示。

   
    如图 3 所示，标准品在 10.432min 的时候出峰，而由图 4 可以看出样品在 10.365min 的时候有一个比较明显的峰，由于操作等客观因素的存在，即便是同一种样品出峰时间也可能会有细微的偏差，样品与标准样的出峰时间十分接近，在允许范围内，这就说明了样品中很有可能含有 10－HDA 或者是它的正反结构类似物，其具体结构仍需要做更进一步的准确鉴定。
2.2 气相－质谱色谱分析（GC－MS）
    仪器和分析条件：采用 GCMS-QP2010 气质连用仪；JB-5 毛细管柱、柱长 30m、内径 0.25μm、壁厚0.25μm；进样量 0.1μl；柱温保持 150℃2min，升温到300℃保持 10min；程序升温速度 15℃/min 进样口温度：250℃；柱流速：1 ml/min；分流比 5：1；结果由气质确定发酵液中含有 10－HDA 成分，与标准品质谱图比较，符合系数高达 90%，如图 5 所示。

    
    图 5 是 10－HDA 的标准样谱图，下图是检测样品谱图。由上图可知，标准品在 5.967min 左右出峰，样品与标准品的吻合度达 90％，因此我们可以确定样品中含有 10－HDA。
3 讨论
   由实验可知道，产 10-HAD 的微生物菌株在自然界中是能够筛选得到的，用液相测定时，其含量能达到0.25%，当然还需要进一步优化提高。但在实验中我们了解到菌株产 10-HDA 不稳定，在同样的条件下，产 10-HAD 也是时有时无。这可能与 10-HAD 的特殊结构有关，其结构虽然不复杂，却在微生物代谢过程中很难形成，并且由于其产生的代谢途径不清楚，所以给实验带来了困难，需要更进一步深入的研究,一旦研究成功，将在很大程度上代替物理提取和化学合成方法。
参考文献略