微生物卤代酶研究进展
2009-12-09 14:36:28   来源：本站原创   评论：0 点击：

作者单位：国家海洋局第三海洋研究所， 厦门361005

【摘要】  迄今为止，已经发现了近3800种卤化物，其中很多是重要的抗生素。对这些抗生素的卤化机制的研究发现了四类负责生物卤化的卤代酶。本文综述了这四类卤代酶的特点，并介绍利用卤代酶基因为探针发现海洋放线菌中新抗生素生物合成基因簇的研究进展。

【关键词】  卤代酶； 抗生素； 生物合成基因； 海洋微生物

advance in research on the halogenase from microorganism

    tang xiao?min  and  xu jun

    (third institute of oceanography, state oceanic administration,  xiamen 361005)

    abstract  nearly 3,800 halogenated compounds have been identified so far and many of which are important antibiotics. the microbial halogenases involved in antibiotic biosynthesis could be classified into four categories. this review will introduce the characteristics of each type of the halogenases and the advances in the bio?prospecting of novel antibiotic biosynthetic gene clusters from marine actinomycetes by using the halogenase gene as probe.

    key words  halogenase;  antibiotics;  biosynthetic gene;  marine microbe

     三十年前大约只有200多种天然有机卤化物被发现［1］。当时人们认为这些卤化物大多为人工合成化合物，自然界生成的卤化物很少。随着分离纯化技术的改进及人们对新药研究热情的不断增加，迄今为止已经从各种生物(包括细菌、真菌、各类动植物)中分离出3800多种卤化物，其中大部分由海洋生物产生［2］。约95%的卤化物为氯化和溴化物，氟化和碘化物很少，少数化合物既含氯也含碘［3］。

    许多卤化物，如氯霉素(chloramphenicol)、7?氯四环素(7?chlorotetracycline)、万古霉素(vancomycin)等都是重要的抗生素(fig.1)。虽然卤素原子的类型、数量以及位置对化合物生物活性的影响没有特定的规律［4］，但某些卤化物与相应的非卤化物相比，卤化可以增强其生物活性。如，2?氯硝吡咯菌素的抗真菌活性只有硝吡咯菌素(含有2个氯原子)的10%［5］；与其含氯衍生物相比，不含氯的rebeccamycin没有抗菌活性［6］。虽然到目前为止对有卤素原子参与的有机化合物的合成机制还有待深入研究，但至少已经发现了四类负责生物卤化的卤代酶。

    1  卤代酶的分类

    1.1  卤过氧化物酶(haloperoxidases)

    (1)含有血红素的卤过氧化物酶(heme?containing haloperoxidases)  第一个参与抗生素生物合成的卤代酶是从产生化合物caldariomycin的真菌caldariomyces fumago中分离到的。这个酶需要过氧化氢及卤素离子(氯、溴或碘，不包括氟)来催化卤代反应，因此被称为卤过氧化物酶［7］。早期的研究主要是利用36cl来检测卤过氧化物酶的活性， 后来hager等基于fig.1    chemical structure of halogenated compounds

    caldariomycin生物合成的中间体单氯双甲酮(mono?chlorodimedone，mcd)建立了一种光谱分析方法，这种方法后来发展成为检测卤代酶活性的标准方法。由于卤过氧化物酶是胞外酶而caldariomycin是在真菌细胞内合成的，尽管在体外卤过氧化物酶能催化其中间体的氯化，却一直无法证明卤过氧化物酶确实参与了caldariomycin的生物合成［4］。进一步的研究表明该酶具有催化p450型反应的催化活性，在h2o2和卤离子存在时能产生自由酸作为卤化剂，从而解释了这种酶为什么缺乏底物特异性和区域选择性［8］。

    (2)含有钒的卤过氧化物酶(vanadium?containing haloperoxidases)  人们从藻类、苔藓和真菌中发现了另一种卤过氧化物酶——含有钒的卤过氧化物酶，这种酶的活性依赖于钒与其活性位点结合。与含有血红素的卤过氧化物酶相似，这种酶在h2o2存在时氧化卤素原子(氯、溴或碘，不包括氟)产生自由酸作为卤化剂，因此也缺乏底物特异性和区域选择性［9］。

    (3)过氧水解酶(perhydrolases)  利用mcd光谱分析法，van pée等［10］从产卤化物的假单胞菌和链霉菌中分离到了一种具有卤化活性的酶。这种酶既不包含血红素也不需要钒，由于其催化卤代反应的过程需要h2o2，因此这类酶曾经归为卤过氧化物酶。进一步的结构研究表明，这类酶属于α/β水解酶，生化研究表明其活性依赖于短链羧酸［11］。与含有血红素及钒的卤过氧化物酶相似，这类酶同样缺乏底物特异性和区域选择性。

    1.2  fadh2依赖型卤代酶(fadh2?dependent halogenases)

    第一个fadh2依赖型卤代酶是dairi等［12］在研究7?氯四环素的生物合成途径过程中发现的。他们在用源于7?氯四环素合成基因簇的一个2.6kb的基因对只产生不含氯的四环素突变株进行功能互补后发现这个基因编码一个卤代酶，该酶的核苷酸序列及氨基酸序列与已知卤过氧化物酶、过氧化物酶或过氧水解酶都没有相似性。hammer等［13］在研究荧光假单胞菌bl915中硝吡咯菌素(pyrrolnitrin)的生物合成基因簇时(fig.2)，发现此基因簇由4个基因prnabcd组成，它们催化了色氨酸到硝吡咯菌素的转化。在荧光假单胞菌突变体中prna和prnc表达时发现其产物在有nadh、o2和氯离子存在的条件下分别催化了色氨酸和单去氯氨基硝吡咯菌素的氯化。将prna纯化后发现其活性依赖于fadh2，而且nadh对于一非特异性的黄素还原酶是必需的。进一步的研究表明这种黄素还原酶能从fad和nadh产生卤代酶所必需的fadh2，因此这种新型卤代酶被称为fadh2依赖型的卤代酶［14］

    这类酶具有底物特异性和很强的区域选择性。对这类卤代酶基因进行研究发现其包括两个保守区，一个是fad结合位点(gggxxg)，另一个含有两个色氨酸残基(gwtwxip)［15］。 dong等［16］深入研究了    fig.2    pathway for pyrrolnitrin biosynthesis in

    pseudomonas fluorescens

    prna的反应机制，发现氯离子对由fadh与o2反应产生的过氧黄素进行亲核进攻产生hocl，hocl通过该酶中色氨酸和fad间长度为10?的隧道，而被隧道中的残基激活后作用于其底物色氨酸，以完成位置选择性的卤化作用。

    目前，越来越多的研究表明在许多抗生素的生物合成基因簇中存在fadh2依赖型的卤代酶，这些抗生素包括chloroeremomycin、balhimycin、7?氯四环素、藤黄绿脓菌素(pyoluteorin)、pentachloropseu?dilin、rebeccamycin、thienodolin等，提示fadh2依赖型卤代酶是生物卤化的主要机制［4］。

    1.3  非血红素fe2+α?酮戊二酸及o2依赖型卤代酶(non?heme feii α?ketoglutarate? and o2?dependent halogenases)

    在研究syringomycin e和barbamide生物合成途径时没有发现与fadh2依赖型卤代酶有相似性的基因［17］。barbamide基因簇中的barb1/barb2与syringomycin基因簇中syrb2的氨基酸序列有很高的相似性，这类蛋白属于一类非血红素fe2+α?酮戊二酸依赖型酶，提示这类酶可能负责syringomycin e和barbamide合成中的氯化［18］。vaillancourt等［19］的研究证实了syrb2的卤化活性，它催化了连接在转运蛋白syrb1上的l?苏氨酸的氯化。第二个非血红素fe2+卤代酶存在于非卤化的刺冠素的生物合成过程中［20］，但其催化机制尚未完全清楚。

    1.4  s?腺苷甲硫氨酸依赖型氯代酶(s?adenosyl?l?methionine dependent chlorinases)

    salinosporamide a是近年来才发现的海洋专属放线菌salinispora产生的一种新的抗肿瘤药物，eustáquio等［21］深入研究了参与salinosporamide a生物合成的氯代酶sall，发现sall的氯代机制与之前发现的几类卤代酶完全不同，属于一类新的氯代酶。

    在salinosporamide a的生物合成过程中，s?腺苷甲硫氨酸与氯离子通过一种少有的亲核取代方式产生5′?氯?5′?脱氧腺苷(5′?chloro?5′?deoxyadenosine，5′?clda)和l?甲硫氨酸；5′?clda进一步反应生成chloroethylmalomyl?coa。chloroethylmalomyl?coa作为卤代的pks底物参与了salinosporamide a的生物合成［21］，这是一种全新的有机氯同化作用，为卤代聚酮化合物的基因工程改造提供了新的酶学基础。

    2  卤代酶的应用研究

    目前，对卤过氧化物酶的应用研究还比较少，其主要障碍是卤化依赖于可扩散自由酸的形成而没有区域选择性，常常得到与化学卤化相同的产物。利用fadh2依赖型卤代酶则有可能形成新的卤化物，其应用主要体现在以下两个方面。

    2.1  在组合生物合成中的应用

    卤素原子的加入能增强很多抗生素的生物活性，但通过化学合成来制备这类化合物非常昂贵，而通过直接操纵卤代酶基因为产生新的抗生素化合物提供了可能。例如sánchez等［22］在白色链霉菌中共表达rebeccamycin和staurosporine的生物合成基因簇获得了新的杂合抗生素，并把来源于pyrrindomycin和thiendolin生物合成途径中的卤代酶分别引入该工程菌株，获得了在不同位置氯代的两种新型吲哚咔唑类化合物。虽然该合成过程只限于以色氨酸为底物，但该研究首次证明了通过遗传操作获得新卤化物的可行性。

    2.2  在寻找新化合物方面的应用

    由于fadh2依赖型的卤代酶是许多抗生素生物合成基因簇中的后修饰酶，因此，基于与avilamycin、simocyclinone、balhimycin、complestatin、ansamitocin和calicheamicin合成相关的卤代酶的氨基酸序列，hornung等［23］设计了简并引物，试图从一些放线菌中发现新的卤代酶基因，并希望以此为切入点，发现新的抗生素合成基因簇。实验结果表明，在随机筛选的500株放线菌中约有1/5的菌株含有潜在的fadh2依赖型卤代酶基因，从其中1株菌株中克隆了包含卤代酶基因及与其连锁pks ii型基因的整个抗生素生物合成基因簇，并在白色葡萄球菌中进行了异源表达，发现了一种新的卤代糖肽类化合物cb2364?i。

    笔者所在的课题组应用上述引物，对167株红树林放线菌基因组中的卤代酶基因进行了初步筛选，发现至少有34株放线菌含有卤代酶基因片段。对这些酶基因的氨基酸序列比对分析表明它们分为6类，可能分别修饰糖肽类i型(vancomycin)和v型(complestatin)、环式酯肽(lipodepsipeptide)、安莎类(ansamycin)、烯二炔类(enediyne)及氧杂蒽酮类(xanthone)的化合物。值得一提的是，从含有可能修饰安莎类化合物的卤代酶基因的菌株中还扩增到安莎类生物合成的起始单元3?氨基?5?羟基苯甲酸(ahba)的生物合成基因，且其发酵产物tlc分析可发现安莎类聚酮化合物的特征显色，因此推测此菌株有可能产生一类新的含氯安莎类。此外，从另一株含有可能修饰环式酯肽抗生素卤代酶基因的菌株中可检测到特征性非蛋白氨基酸enduracidin的生物合成基因，且发酵产物的抗菌谱与enduracidin十分吻合。现已获得该菌株中可能存在的环式酯肽抗生素生物合成基因簇的部分基因克隆，序列分析结果表明为完整的卤代酶基因及与其连锁的抗生素生物合成基因。鉴于以上两株菌来源于红树林这一特殊生物环境，且两者的16s rdna序列分析结果都提示它们极有可能为上述两类重要抗生素的新产生菌。这些研究表明通过寻找新型的卤代酶，可以发现新型的抗生素合成基因簇，进而有可能发现新的活性化合物。

    3  展望

    微生物来源的天然产物一直是发现新药物先导化合物的重要来源。经过长期和广泛的研究后，从陆地微生物中发现新的天然产物已十分困难，而蕴涵着极其丰富生物资源的海洋微生物种群则是当今天然产物药物开发的巨大宝库。随着核酸序列分析和化合物检测分析技术的不断更新发展，对微生物基因组信息的解析日益与蛋白组、代谢组等研究手段紧密结合，在未知基因功能分析、生物合成基因的产物分析等方面获得了长足的进步。海洋环境是地球上最大的富含卤素的生态环境，已经发现的含卤素的新抗生素如salinosporamide a就来源于海洋微生物。因此，从上述四类负责抗生素卤化的卤代酶基因序列和催化机制研究出发，有可能从海洋微生物中发现新型的卤代酶，进而获得与其连锁或与之相关的抗生素生物合成基因簇，为该类海洋微生物天然产物的研究开发奠定基础。