多杀菌素的研究及其在储粮害虫防治中的应用
2009-06-04 16:29:28   来源：本站原创   评论：0 点击：

张晓琳 ¹  曹阳  宋渊   郭伟群²

（1. 国家粮食局科学研究院，100037；2. 中国农业大学国家农业生物技术重点实验室，100094）

摘要  多杀菌素（spinosad）是一种具有触杀和摄食毒性的广谱生物杀虫剂，能有效防治多种储粮害虫、应用剂量低、持效期长、低残留、无交互抗性，具有对害虫高效、对环境安全、对哺乳动物低毒的优异特点。因而被认为是一种极具前景的“绿色”储粮防护剂。文中就多杀菌素的结构、理化性质、作用机理和生物活性、发酵生产技术以及在储粮害虫防治中的应用等进行了综述。

关键词  多杀菌素  多刺糖多孢菌  生物杀虫剂  储粮防护剂

虫害是导致储粮数量损耗，引起粮食霉变，降低粮食品质的主要因素^[1]。我国目前对储粮害虫的防治主要依赖于化学药剂。但是长期大量使用化学药剂，一方面导致了储粮害虫普遍对化学药剂产生抗性^[2]；另一方面，有的杀虫剂影响非靶标昆虫，某些益虫被无意中消灭，导致其次要害虫急剧增长，产生灾难性后果；更重要的是化学药剂残留的问题日趋严重，不仅造成了严重的环境污染，而且给人类的健康带来巨大的威胁^[3]。为此，各国科学家都试图去寻找一种新型安全的杀虫药剂来防治储粮害虫。

多杀菌素（spinosad）是一种具有触杀及摄食毒性的新型微生物源杀虫剂，具有对害虫广谱高效、对人、非靶标动物和环境极为安全、可生物降解的优异特点，并因此获得美国“总统绿色化学品挑战奖”^{[4, 5]}。多杀菌素首先于1997年在美国被批准登记，商品名为Tracer，用在棉花上。2005年，多杀菌素已经被批准用于73个国家的250多种作物上。由于多杀菌素能有效防治多种储粮害虫、用药量极少、持效期长、安全高效、低残留，因而被认为是一种极具前景的“绿色”储粮防护剂。2005年美国已批准多杀菌素用于存储谷物与种子保护。目前，国内对多杀菌素的研究尚处于试验阶段。

1  多杀菌素的结构

多杀菌素，又名刺糖菌素，是由土壤放线菌多刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)发酵产生的次级代谢产物^[6]。如图1所示，多杀菌素为新型大环内酯类抗生素，但和一般的大环内酯类抗生素相反，多杀菌素没有抑菌活性，却有杀虫活性^[6]。

1990年，Boeck等人^[7]首次从刺糖多孢菌NRRL-18395的天然发酵产物中分离出了多杀菌素组份spinosyn A, B, C, D, E, F, H, J和多杀菌素A拟糖苷配基，其中多杀菌素A(spinosyn A)组份约占85%~90%，多杀菌素D(spinosyn D)组份约占10 %~15 %，其余均为次要组分。到目前为止，另外还发现了15种多杀菌素类化合物^[8-10]，包括组份K, L, M, N, O, P, Q, R, S, T, U, V, W, Y。多杀菌素的母核是由一个5, 6, 5-顺-反-顺三环和一个十二元的内酯环粘合而成，并通过糖苷键连接着两个不同的六元糖，其中一个是氨基糖β-D-福乐糖胺(D-forosamine)，另一个是中性糖α-L-鼠李糖(L-rhamnose)。多杀菌素不同组份的区别主要在于两个糖基上的N-和O-甲基化的不同或母核上C-甲基化的不同^{[11, 12]}。

2  多杀菌素的理化性质^{[4, 8]}

纯的多杀菌素为白色或浅灰白色的固体结晶，带有一种类似于轻微陈腐泥土的气味，是85%~88%的多杀菌素A组份和12%~15%的多杀菌素D组份的混合物。多杀菌素不易溶于水，易溶于有机溶剂，例如：甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、二甲基亚砜及二甲基甲酰胺等。在水溶液中pH值为7.74，对金属和金属离子在28天内相对稳定, 商业化产品的保质期为3年。多杀菌素在空气中不易挥发。表1概括了多杀菌素A和D的一些物理、化学性质。

多杀菌素在环境中通过多种途径组合的方式进行降解, 主要为光降解和微生物降解, 最终变成碳、氢、氧、氮等自然组份。由土壤光解作用降解的多杀菌素半衰期为9~10天，而水光解作用的半衰期则小于1天，叶面光降解的半衰期是1.6～6天。在无光照条件下多杀菌素经有氧土壤代谢的半衰期为9～17天。另外多杀菌素的沥滤性能非常低，合理使用不会对地下水构成威胁。

表1 多杀菌素A和D的物理与化学性质

3  多杀菌素的作用机理和生物学性质

3.1  多杀菌素的作用机理和抗性治理

多杀菌素具有全新的作用机理^[13]，它并不作用于乙酰胆碱酯酶和Na＋通道，使之不同于传统的有机磷和拟除虫菊酯类杀虫剂。实验证明它对昆虫存在快速触杀和摄食毒性。它的作用方式是通过刺激昆虫的神经系统，导致非功能性的肌收缩、衰竭，并伴随颤抖和麻痹。这种作用结果和烟碱型乙酰胆碱受体被激活的结果是相一致的，显而易见这一作用机制在已知的害虫防治产品中是新颖和独特的。多杀菌素同时也作用于γ-氨基丁酸受体，有可能这进一步促成了其杀虫活性的提高，如此的作用模式可谓独一无二^[12]。吡虫啉和其他的烟碱性受体类的杀虫剂与多杀菌素的作用位点是不相同的。阿维菌素尽管也是一个天然产物，且同为大环内酯类，但其作用位点亦和多杀菌素不尽相同。迄今为止，尚未发现某类产品能以相同的作用方式影响昆虫的神经系统，而且尚无有关多杀菌素交叉抗性的报道。

多杀菌素具有独特的杀虫作用机制，符合抗性治理的理念，与现存化学药剂无交互抗性，可以与现有的虫害防治产品轮换应用。此外，多杀菌素对捕食性昆虫具有选择性，以及适度的残留特性，这些都大大降低了抗性发展的可能性。但是正如不断增长的杀虫剂抗性发生数量所表明的那样，昆虫的普遍适应性已经一而再地被证明。因此要加强多杀菌素抗性治理方面的研究，根据不同作物、害虫种类、地理区域差异，对主要害虫进行专门的抗性治理战略。

3.2  多杀菌素的杀虫谱和毒性

多杀菌素属广谱杀虫剂，试验证明多杀菌素能有效地控制鳞翅目、双翅目和缨翅目害虫, 另外它还可以很好地防治鞘翅目和直翅目中某些大量吞食叶片的害虫种类^[14-16]。多杀菌素对鳞翅目幼虫的活性大大地大于各种有机磷、氨基甲酸酯杀虫剂，与拟除虫菊酯相当。多杀菌素具有高杀虫活性的同时, 对捕食性昆虫还表现出较低毒性, 对鳞翅目昆虫而言,多杀菌素是已发现的杀虫剂中选择性最高的化合物之一。此外，多杀菌素对蓟马、虱、白蚁以及许多膜翅目害虫也有较好的效果。

根据中国农药毒性分级标准，多杀菌素属低毒杀虫剂。它对哺乳动物和鸟类相对低毒，对水生动物也只是轻微的中等毒性。另外, 对哺乳动物的慢性毒理试验表明多杀菌素无致畸、致突变、致癌作用或神经毒性^[17]。表2数据表明，多杀菌素的用量和毒性均低于目前常用的几种储粮杀虫剂。同时，多杀菌素对许多益虫和有益生物也具有很高的安全阈界，相比之下它对捕食性甲虫、口器昆虫、草蛉和螨类毒性较低。较之传统的氯氰菊酯, 多杀菌素对一些重要的有益昆虫都显示出较低的杀虫活性, 而在防治鳞翅目害虫时,多杀菌素和氯氰菊酯两者的活性强度通常不相上下^[18]。因此，多杀菌素是进行害虫综合治理的首选。

表2  多杀菌素与其它储粮杀虫剂的毒性比较

4  多杀菌素的发酵生产技术

利用放线菌多刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的研究在国内还处于起步阶段，产素水平比较低，距工业化生产还有较大的距离。

4.1  多杀菌素产生菌株的选育

4.1.1  菌种特性^[19]

多刺糖多孢菌是好氧型革兰氏阳性放线菌, 它是由一位化学家在加勒比海度假时从一个废弃的糖蜜酒厂附近土壤中分离得到的，通过对其发酵液的抗蚊虫幼虫活性测定发现了多杀菌素。多刺糖多孢菌NRRL18395在大多数培养基（如YMS、ATCC174、苹果酸钙等）上都能生长良好，形成气生菌丝体。气生菌丝为粉黄色，营养菌丝为黄色到黄褐色，产浅粉黄色孢子，在某些培养基上则产生白色孢子。孢子链外观为珠状，有孢子壳，孢子壳表面为针状，这些针状物约1mm，环绕在末端上。孢子形状为椭圆形，平均大小约为1.1×1.5μm。孢子链长度大大超过50个孢子。菌体生长温度为15℃～37℃, 对溶菌酶敏感，在高渗条件下（11 %NaCl）可以生长。

4.1.2  菌种选育

与其它抗生素产生菌一样，多杀菌素产生菌的产素水平主要也决定于环境条件和自身的遗传因子两个方面。改良发酵条件只能在较低水平上提高目的菌株的产素水平，通过高产菌株育种技术改变菌株的部分遗传信息，能有效地提高目的菌株的产素水平。多种育种方式的交替使用将有助于抗生素产素潜力的发挥^[21]。常规诱变方法作为一种经典的传统诱变方法，在抗生素发展史上有其光辉及重要的位置。特别是在一些抗生素产生菌的遗传背景和生物合成途径尚未清楚的情况下，这种传统的诱变方法仍是提高产量、改变菌种不良性状的有效手段。刺糖多孢菌作为一种新型大环内酯类抗生素的产生菌，遗传背景和生物合成途径尚未搞清楚，故一般采用常规诱变方法进行菌种选育。目前国内学者在刺糖多孢菌菌种选育中常用的常规诱变方法主要有：紫外（UV）诱变，UV和氯化锂（LiCl）复合诱变，硫酸二乙酯（DES）诱变，亚硝基胍（NTG）诱变，DES和LiCl复合诱变，⁶⁰Co诱变等^[20-22]。

4.2  多杀菌素发酵培养研究

提高多杀菌素产量可以从两个方面着手，一是诱变育种改变菌种的遗传背景，获得高产菌种；二是给菌种一个最适发酵培养条件，使其产生高效价的性状得以充分表达。

4.2.1  多杀菌素的摇瓶发酵

将保藏于冷冻干燥管或液氮安瓿瓶中的菌种转接斜面或平皿，斜面培养基及平皿分离培养基为：酪蛋白水解物，牛肉膏，葡萄糖，琼脂。接种后的斜面28℃培养8～10天后接种于种子摇瓶。摇瓶种子培养基为：葡萄糖，淀粉，精氨酸，黄豆粉，玉米浆，酵母浸出粉，CaCO₃，pH 6.3。摇瓶装量为500m1三角瓶装100ml培养基，28℃于旋转式摇床(偏心距4cm)160r／min培养72h。之后以5%的接种量接种于摇瓶发酵培养基。摇瓶发酵培养基为：葡萄糖，淀粉，精氨酸，黄豆粉，玉米浆，酵母浸出粉，CaCO₃，pH 7.0。装量同种子摇瓶，28℃于同条件摇床上培养6～8d。用于产物的测定或分离纯化^[20]。

4.2.2  多杀菌素的搅拌式生物反应器发酵

用来培养多刺糖多孢菌生产多杀菌素的培养基可以是多种培养基中的任意一种，但是从生产的经济、产率和产物易分离的角度看，需要优选出某些培养基。例如：大规模发酵时优选的碳源为葡萄糖和麦芽糖，但也可使用核糖、木糖、果糖、半乳糖、甘露糖、甘露醇、可溶性淀粉、土豆糊精、油酸甲酯、油类等。优选的氮源为棉子糖、胨化牛奶和消化大豆粉，也可使用鱼粉、玉米浸膏、酵母膏、酪蛋白水解物、牛肉膏等。可掺入培养基中的营养可溶无机盐离子有锌离子、钠离子、镁离子、铵离子、氯离子、碳酸根离子、硫酸根离子、硝酸根离子等。菌体生长的必需微量元素一般作为杂质存在于培养基的其它成分中，其含量足以满足微生物的生长需要。常规消泡剂会抑制多杀菌素的产生。如有发泡问题，可以在培养基中加入少量豆油。

刺糖多孢菌产多杀菌素的最适温度为28℃～30℃。由于多杀菌素的生产是一个需氧发酵过程，因此大规模发酵时应通过通气量和搅拌速度来维持罐内溶氧在65％以上^{[8, 23]}。

4.3  多杀菌素的分离提纯和测定

多杀菌素是亲脂的，如果在发酵中使用大量的油类，多杀菌素将会部分被提取到发酵液中，此时需采用全发酵液提取；如果不使用或只使用少量油类，则绝大部分多杀菌素存在于菌丝体中，这种情况下先过滤得到菌丝体再提取多杀菌素更为有效。

目前国内对多杀菌素的分离提纯尚未有实质性研究。根据国外文献，多杀菌素主要有以下2种分离纯化方法：

4.3.1  溶剂萃取法：在发酵液中加入等体积的丙酮萃取，过滤，滤液用NaOH调pH至10；加入1/2发酵液体积的乙酸乙酯，分层后弃去水相；有机相减压浓缩到1/2发酵液体积；用1/2发酵液体积的酒石酸(0.1mol/L)萃取，分层后弃去有机相；减压蒸发除去水溶液中可溶性的乙酸乙酯；利用反渗透操作浓缩水溶液；用NaOH调节浓缩后水溶液的pH值至10～11，过滤，分出沉淀物；水洗，真空干燥，得到多杀菌素成品^[10] 。

4.3.2  HPLC跟踪检测法：在发酵液中加入等体积的丙酮萃取，过滤除去菌体；滤液用NaOH调pH至13；上HP-20ss吸附树脂，用含0%～95%的甲醇∶乙腈＝1∶1(含0.1%乙酸钠)溶液梯度洗脱多杀菌素A和D组分，利用HPLC跟踪检测，分段收集洗脱液；将多杀菌素洗脱液浓缩得浓缩液；将浓缩液用石油醚稀释，上硅胶层析柱，用石油醚和甲醇梯度洗脱，利用HPLC跟踪检测，分段收集洗脱液，分别得到多杀菌素A和D的洗脱液^{[10, 24]}。

高效液相色谱 (HPLC)法是多杀菌素测定的常用方法，其各个组份都可用HPLC进行定性或定量分析。对多杀菌素A组份和D组份测定时可采用如下HPLC系统^[25]：色谱柱为C18柱；流动相为乙腈、甲醇及水的混合物(2:2:1)，其中含少量乙酸铵；检测波长为245nm。另外, Lee等人^[26]还报道了采用荧光免疫测定方法检测多杀菌素A组份。

5  多杀菌素在储粮害虫防治中的应用

多杀菌素作为一种生物杀虫剂，兼具生物农药的安全性和化学合成农药的速效性特点，目前有73个国家已注册在250多种的作物上应用。自从1997年第一次有产品出现，多杀菌素一直维持高效和安全性的工业记录。目前, 多杀菌素商业化的品种有用于棉花的Tracer（中文商品名为催杀）, 用于林业、蔬菜类作物的Success（中文商品名为菜喜）和SpinTor，以及用于草皮、观赏植物、家蝇诱饵的Conserve。有很多多杀菌素产品被有机物评论组织推荐在有机农业中使用。由于多杀菌素能有效防治主要储粮害虫，以及对环境无污染，被认为是储粮防护剂中最好的药剂。多杀菌素于2005年在美国注册为储粮杀虫剂。虽然美国把多杀菌素作为储粮防护剂的使用体系已经建立，但是包含多杀菌素的商业化产品直到重要国际贸易标准或注册体系已被建立起来才能销售，美国陶氏益农公司（Dow Agrosciences Company）计划于2007年在全球推广。

近几年，美国堪萨斯大学谷物科学和工业系的Bh. Subramanyam, M. D. Toews和L. Fang对利用多杀菌素防治储粮害虫进行了较为详细的研究^[27-31]。研究结果总结于表3、表4和表5。

表3  多杀菌素作为储粮防护剂（1mg/kg）在实验室的效果

从表3中可以看出，1ppm多杀菌素就能完全防治印度谷蛾、麦蛾、谷蠹、杂拟谷盗、锈赤扁谷盗、米扁虫。对米象、赤拟谷盗、锯谷盗、玉米象的防治效果有待于观察。多杀菌素在玉米中防治赤拟谷盗和锯谷盗、米象、玉米象比在小麦中防治效果好。

多杀菌素通过破坏储粮害虫的各个虫态来防止害虫侵袭及其后代的生长，因此，在实验室的研究不能完全说明它的防治效果。长期研究表明，在田间或仓库的条件下，多杀菌素重点是对害虫种群的影响和对整个生活史的控制。表4是在自然条件下在粮仓中用多杀菌素处理的结果。

表4  多杀菌素作为储粮防护剂（1mg/kg）的实仓实验研究结果

注：美国俄克拉荷马州实仓

在堪萨斯州试验仓条件下，1ppm 多杀菌素在粮食中可以保持一年。在同样条件下温度从-10到32℃变化时，没有明显的损失。多杀菌素在水分为12.5％到14.5％的小麦中的杀虫效果没有什么变化。同时，统计表明1ppm 多杀菌素在温度和水分变化的条件下可以100％控制谷蠹达1年之久。这表明，多杀菌素能有效防治谷蠹，并不受温湿度条件的影响。

表5  多杀菌素作为储粮防护剂（1mg/kg）实验总结

注：＋＋＋表示1ppm多杀菌素几乎可以完全控制害虫。

实验室研究和实仓实验研究已经表明大部分储粮害虫种类只需1ppm 多杀菌素就能通过破坏其生活史来达到防治效果。1ppm 多杀菌素肯定能防治的害虫有：印度谷蛾、米蛾、其它鳞翅目害虫、谷蠹、锈赤扁谷盗、米扁虫、杂拟谷盗。1ppm 多杀菌素完全可以防治或接近，但数据还需要研究的害虫有：赤拟谷盗、锯谷盗、米象、玉米象^[27-31]。

在田间作物上，多杀菌素由于太阳光照的紫外线引起光降解^[32]，在1周后就失去活性^[33]，而在仓库中，由于没有光照，多杀菌素在1年的储藏期内几乎不分解，杀虫活性也几乎没有降低，持效时间可长达1～2年^[28]。此外，多杀菌素具有独特的作用机制且对害虫无抗性或与其它产品无交互抗性，因此可安全应用于实践。美国已有12个州在2002～2003年在商业粮库中使用多杀菌素。

另一项研究表明，多杀菌素对于重要储粮甲虫具有卓越的触杀作用。把多杀菌素喷洒在粮库表面、缝隙或粮食加工厂的设备上，就能有效地防治各种储粮害虫。

目前被美国注册在粮食上使用的粮种主要有大麦，鸟饵，玉米（田间，甜玉米，爆米花用的和种用玉米）、狐尾草、栗、珍珠稷、稷，燕麦、稻谷、高梁、小麦、和其它非谷物种子（花，草，观赏植物）；为了保护粮食、饲料和油料作物免受害虫的危害，害虫种类主要包括谷蠹、印度谷蛾、米象、米蛾、粉斑螟、杂拟谷盗和米扁虫，其它害虫如米象、谷象、玉米象、赤拟谷盗、锯谷盗和锈赤扁谷盗的防治效果不大好；多杀菌素的最大使用剂量为：1mg/kg，即使抗性很高的害虫使用1ppm 多杀菌素防治就行。剂型有液体和干粉两种。

我国目前几乎没有开展多杀菌素防治储粮害虫的应用研究。曹阳等人测定了2.5%菜喜悬浮剂对嗜虫书虱、锯谷盗和米象三种主要储粮害虫的毒力。结果表明，多杀菌素对这三种主要储粮害虫都有较好的触杀效果，其LC₅₀分别为0.0022、0.0046、0.0059mg/m2，在0.016 mg/m²的浓度下，48小时的防治效果均达90％以上，特别是对嗜虫书虱的触杀作用显著高于锯谷盗和米象^[34]。

6  结语

由于长期大量使用化学药剂，不仅对粮食和环境造成污染，还导致储粮害虫产生严重抗性，因此，以低毒的新型生物源杀虫剂取代目前大量使用的毒性较高的化学药剂，已越来越受到重视，并成为研究开发的热点。多杀菌素作为微生物源杀虫剂家族中的一员已经实践证明是最为成功的范例之一。它的优越性能包括：防治范围广，对大部分储粮害虫具有极高的活性；应用剂量低；对哺乳动物、鱼类、鸟类低毒；对益虫安全；化学结构和作用机制独特，无交互抗性。由于多杀菌素的优越性能，使其有望成为新一代储粮防护剂的主要品种。在国内，目前对多杀菌素的研究开发还只停留在实验室小试阶段。因此，我国应加快多杀菌素生产技术的开发研究步伐，并结合我国粮食仓储行业的实际情况，进行实仓应用技术的开发，从而减少化学药剂的使用量，延缓储粮害虫抗药性的发生和发展，最终促进我国绿色储粮技术的发展。

参考文献

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