左旋多巴的合成与提取
2009-03-25 11:36:34   来源：健康网   评论：0 点击：

 [关键词]： 左旋多巴,,帕金森病,酪氨酸酚解酶,提取
  
    摘要：左旋多巴（L-DOPA）是治疗帕金森病的有效药物。L-DOPA的生产方法有化学合成、从植物中提取和微生酶物转化等，其中利用微生物的酪氨酸酚解酶以邻苯二酚、丙酮酸和氨为底物合成L-DOPA被证明是一种最经济且最有前途的方法。应用基因工程技术构建高效菌株。左旋多巴的提取有多种方法，其中向反应体系中加入晶种使多巴从反应体系中析出，除去菌体和杂质，再进行重结晶可得到纯度较高的多巴是一种很好的方法。

    中图分类号：R914.5 文献标识码：A 文章编号：1006-8376（2000）04-0033-06

    左旋多巴（3，4-dihydroxylphenylalanine,LDOPA）是生物体内一种重要的生物活性物质，是从L-酪氨酸到儿茶酚或黑色素的生化代谢途径过程中的重要中间产物。L-DOPA是治疗常见老年病--帕金森病（Parkinsons disease）的主要药物。据统计，普通人群帕金森病的发病率为0.1%，60岁以上老人的发病率为1%，80岁以上的发病率为2%。随着人口老龄化速度的加快，对L-DOPA的需求将迅速增加。据1993年国家对消耗外汇的100种药物的统计，L-DOPA的进口总金额居第17位。60年代末，国外一些学者开始致力于微生物酶法合成L-DOPA的研究。70年代初，日本学者Yamada等对微生物酶法合成L-DOPA进行了深入的研究，通过菌种选育及发酵条件的优化于1993年在味之素公司投入工业化生产。目前国外L-DOPA的产率超过100mg/ml.80年代后期，武汉大学的彭珍荣等在国内首先开展了微生物法合成L-DOPA的研究，但至今国内尚未有工业化的报道。虽然现在国内有多家制药厂生产L-DOPA及其药剂，但大都是从植物中提取的。

    1 L-DOPA的用途

    多巴的衍生物多巴胺是一种重要的神经递质，但多巴胺不能通过血脑屏障而进入脑组织，而L-DOPA可以通过血脑屏障，在脑组织中可脱羧形成多巴胺，可增加多巴胺含量而达到治疗帕金森氏病的功效。L-DOPA还有其他许多用途，可用来治疗腿多动综合症、肝昏迷、CO中毒、锰中毒和精神病、心力衰竭、溃疡病、脱毛症、调节人的性功能等。此外，人们还发现L-DOPA有抗衰老的神奇功效。在日本有人利用酪氨酸酶将L-酪氨酸转化，经L-DOPA氧化形成黑色素，作为染发的商品出售。L-DOPA是一种在医药卫生、保健美容等诸方面有显著功效的氨基酸衍生物。

    2 L-DOPA的合成

    目前，L-DOPA的生产有化学合成、从天然植物中撮以及微生物酶转化法三条主要途径，各条生产途径的概述如下：

    2.1 L-DOPA的化学合成

    1911年人们首次利用3，4-碳酰二氧苯甲醛为原料化学合成多巴，后来人们还利用胡椒醛、香草醛、儿茶酚、酪氨酸来合成L-DOPA。国内还有人用的D-麻黄碱拆分N-乙酰-3-（3，4-二甲氧基苯）-DL-丙氨酸来合成L-DOPA，70年代初，国外化学合成多巴的产量已达150吨。虽用化学法合成多巴的途径有许多，但遇到一个主要的困难是合成出来的产品是D-型和L-型的混合物，将二者分开较困难。由于L-DOPA会引起毒性反应，因此医学上需控制它的旋光度。1990年，西北大学的孙晓莉用不对称催化法合成L-DOPA，但过程复杂难以工业化。

    2.2 从植物中提取L-DOPA

    植物中的天然DOPA都是L-型的。1913年就有人从蚕豆籽苗种豆荚中提取天然L-DOPA，1949年从野生植物藜豆中撮出L-DOPA。国内于1972年从豆科植物藜豆种子中提取L-DOPA获得成功，1974年商品L-DOPA投放市场。从猫豆中提取L-DOPA的得率，从1.5%已提高到3.25%。从植物中撮L-DOPA由于受到原料来源的限制，产量小，远不能满足市场需求。（
 

    2.2.2 利用基因工程菌合成L-DOPA90年代初人们开始运用基因工程的手段获取TPL的基因片段，然后连接到不同的载体中让其在宿主细胞中高效表达。90年Kurusu.Y等人构建了pGRY30-TPL1质粒，此质粒含有来自Escherichia intermedia的酪氨酸酚解酶（I）基因。91年Kurusu,Y等人分析了Escherichia intermedia中TPL结构基因的核酸序列，91年Fukushima.M等人构建了pHTD I质粒，比质粒在E.coli中能高效地表达产生酪氨酸酚解酶。这个质粒产生的酪氨酸酚解酶的量比其亲株Escherichia intermedia多15倍。91年波兰的Polak.J等人从Cfreundii中提取出TPL基因并构建质粒。92年Hideyuki.S等人对Erwinia herbicola AJ2982的TPL基因克隆到E.coli中进行表达，再将培养的细胞转入多巴合成体系中，反应30h后，反应液中多巴含量为105mM（20.7mg/ml）。94年，有人将编码TPL的基因克隆到质粒载体pGY1000和pGY4000中并将其转入E.coli中进行表达，用于L-DOPA的生产。

    3 L-DOPA的提取

    为了获得纯净的符合标准的产品，必须有适宜的L-DOPA的提取方法。利用微生物发酵法生产L-DOPA，其最终发酵产物含有许多不溶和可溶性杂质，必须采用适当的方法除去这些杂质，分离出纯净的L-DOPA。从发酵液中提取L-DOPA的一般步骤为：（1）离心去掉菌体等不溶物，（2）采用适当方法除去一些可溶性杂质，有必要还需脱色，（3）浓缩得到结晶，再采用一定的方法纯化，得到纯净的晶体。以L-酪氨酸为底物用微生物发酵法生产L-DOPA，最后的发酵产物为棕黑色液体，要从其中提取出纯净的L-DOPA，首先必须进行脱色，活性炭脱色法的人们广为使用脱色方法。但采用活性炭进行脱色遇到一些问题，活性炭对各种天然氨基酸具有吸附作用，对芳香族氨基酸表现出最强的吸附力，吸附率达20%左右，因此在L-DOPA提取过程中用活性炭脱色损失较大。近来，有许多研究者研制和寻找新的替代活性炭的脱色剂。

    提取L-DOPA的方法有许多，针对不同的生产方法得到的待提取液，人们采取了各有特点的方法来提取L-DOPA。

    Hitoshi Enei等以活性炭层析法来分离纯化L-DOPA，他们将最终发酵产物的pH用浓盐酸调至1.0，然后酸洗，水洗，最后以氨水洗脱，洗脱液经浓缩后调pH至3.5，得到沉淀以酸碱法重结晶得到纯净L-DOPA，得率为56%。Tomohisa Nagsaki等最终发酵产物用10%HCI调pH至2.5；然后离心去掉菌体等不溶物，上清液经真空浓缩后，用乙酸乙酯洗两次，调pH至4.5，放置过夜得粗结晶，粗结晶用等电点沉淀法纯化两、三次，用热水溶化，重新结晶两次，获得较纯晶体，得率为50%。

    Katsuji haneda等采用Dowex 50-4X（200-400目）H+-型树脂来分离L-DOPA，Kaiser，A。等用硼酸复合物来提取L-DOPA，Sealock R.R和Brenner.M.用铅复合物法来提取L-DOPA，但此方法步骤较多，且产品中可能有对人体有害的铅。Blocker.P.等用液态离子交换。

    Micker.D.等发现，在低于30℃的情况下，从过饱和的溶液中结晶出来的L-DOPA为针形晶体，比高于30℃情况下结晶出来的立方形晶体更纯，针形晶体在加热的情况下可变成立方体形晶体。日本在L-DOPA的提取方面作了大量的研究，他们向反应液中添加L-DOPA的无水结晶，在25℃以下继续反应，无水结晶不断析出。反应在25℃以上可析出一水结晶，但向其中加入无水结晶时，析出无水结晶。

    4 展望

    随着我国人口老龄化速度的加快，对L-DOPA的需求将迅速增加。而目前国内市场上的L-DOPA来源绝大部分依靠进口，如何能使微生物法合成L-DOPA在国内投入工业化生产是一个急待解决的问题。运用现代生物技术对菌种进行改造，期望获得高效表达酪氨酸酚解酶的菌株对于提高L-DOPA的产率是非常重要的。另外，固定化细胞法的进一步研究，可提高生产的连续性、稳定性、高效性。虽然L-DOPA的提取方法有多种多样，但L-DOPA易于氧化，这样给提取带来许多不便。又由于L-DOPA大都被用作药来治疗帕金森病，因而对此纯度要求很高，这样对下游提取技术提出更高的要求。（李华钟）