微生物转化洛伐他汀条件的初步研究
2007-12-03 21:24:54   来源：工业微生物   评论：0 点击：

　　洛伐他汀(lovastatin,乐瓦停,美降之)是羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂的一种,它主要是真菌的次生代谢产物,最初由远藤章从Penicillium citrinum的发酵液中发现此物质,之后Merck公司在二十世纪初从土壤中分离得到的As-pergillus terreus也产生洛伐他汀,发现洛伐他汀能明显降低血清中总胆固醇的含量和原发性高胆固醇血症病人的LDL-胆固醇,而且安全性好,因此在1987年获得FDA批准[1]。
　　微生物对洛伐他汀的转化是在1983年由日本学者[2]首次发现,他们在进行美伐他汀(mevastatin)转化成普伐他汀(pravastatin)时,偶然发现MucorhiemalisSANK363672对洛伐他汀也具有转化作用。1990年,Merck公司的研究人员发现actino-myceteMA 6474 (ATCC53828)在适合的条件下,对洛伐他汀的钠盐也具有转化作用,并申请了欧洲专利(EP381478; 08. 08. 90)。在1997年, AntoniaJekkel[3]发现Absidia coeruleuIDR705 (IDR: Insti-tute for Drug Research Ltd., Budapest, Hungary)对洛伐他汀有转化作用,发现转化的产物对HMG-CoA还原酶的抑制效果同洛伐他汀相似。国内对洛伐他汀的生物转化研究很少。微生物转化是利用微生物代谢过程中某一个或一组酶对底物进行催化反应。影响转化率的主要因素有微生物的预培养,微生物的生长和它所需要的转化环境[4]。笔者从本室保藏的放线菌中筛选出对洛伐他汀有转化作用的菌株,对其发酵条件进行了的初步研究。
1　材料与方法
1.1　菌株
　　本实验室所筛选的对洛伐他汀有转化作用的菌株(Nocardiasp. ST2710)。
1.2　主要试剂
　　洛伐他汀(Hisun PHARMA Co, Ltd),甲醇(色谱级,淮阴汉邦科技有限公司), Hycase SF(华美公司分装),超纯水(WATER PRO PS制备),微孔滤膜(上海亚东核级树脂有限公司),其余试剂均为分析纯。
1.3　培养基
　　种子培养基(g/L):KNO31,无水K2HPO40.5,MgSO4·7H2O 0.5,NaCl 0.5,FeSO4·7H2O 0.01,可溶性淀粉20,琼脂20,去离子水1000mL,pH7.2~7.4;
　　转化培养基(g/L):甘露醇5,甘油5,Hycase SF2,牛肉膏1,玉米浆3。
1.4　方法
1.4.1　洛伐他汀的处理
　　1g洛伐他汀分别溶于15mL的二甲基甲酰胺、二
甲基亚砜、丙酮和乙醇,之后向每种溶液中加入85mL
0.1 mol/L的NaOH溶液,微孔过滤除菌备用。
1.4.2　测定方法
　　采用HPLC法,色谱柱: Alltima ODS-2(5μL,250mm×4.6mm);流动相:甲醇-0.5%乙酸(80:20, v/v);流速: 1mL/min;柱温:室温;进样量:10μL;检测波长:237nm;配制不同浓度的洛伐他汀标准溶液,测出峰面积,作标准曲线,以此计算发酵液中的洛伐他汀的残留量,转化产物的计算以洛伐他汀为内标。
1.4.3　培养条件
　　250mL三角瓶装液量为20mL,往复式摇床28℃,100 r/min(冲程8cm)。
2　结果与讨论
2.1　不同溶剂处理底物对转化率的影响
　　以不同溶剂处理底物进行微生物转化时,对溶剂的要求是:(1)对微生物低毒;(2)对转化率是高效;(3)对有机化合物是溶解性好等特点[4]。按1.4.1方法配制洛伐他汀溶液,菌株在种子培养基进行48h预培养后,接入转化培养基中进行培养48h后加入上述不同溶剂处理过的洛伐他汀溶液,使其在培养基中的浓度为500μg/mL,培养120h后,测定产物的产率如图1。
　　从图1可以看出,不同的溶剂对转化率有影响,在这四种有机溶剂中,以DMF处理底物后加入培养基中,转化率为最高,产率可达51.3%;而以丙酮处理底物后,转化率为最低40.6%。不同的溶剂对微生物的生长或转化酶的活力有影响,但影响程度是不同的,本文的结果也说明了这一点[4]。
2.2　转化培养时间的确定
　　菌株ST2710在种子培养基进行48h预培养后,接入转化培养基中培养48h后,加入二甲基甲酰胺处理的洛伐他汀溶液,使其在培养基中的浓度为500μg/mL,继续培养0h、24h、48h、72h、96h、120h和144h后,经微孔过滤,测定结果见图2。
　　从图2可以看出,随着转化时间的增加,转化率也增高,在转化时间为120h时,转化率为最高54%,之后随转化时间的延长,转化率有所降低。所以最适的转化培养时间为120h。
2.3　不同菌龄对产物产率的影响
　　在进行微生物转化时,所加的底物对微生物的生长来说是一种毒害作用[5, 6],只不过某种微生物对此物质有耐受性而已,因此微生物的菌龄对转化率有直接影响。在种子培养基进行48h预培养后,接入转化培养基中进行培养,在培养24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h和120h后加入以二甲基甲酰胺溶解的洛伐他汀溶液,使其在培养基中的浓度为500μg/mL,继续培养120h后,经微孔过滤,测定。同时测定菌体量结果见表1。底物的一系列酶,这与有关文献报导是相符的[4]。
2.4　底物对转化率的影响
　　菌株ST2710先在种子培养基上培养2d,在接入转化培养基之前在转化培养基中加入0.05mL洛伐他汀溶液,之后接入菌体。培养2d再加入0.9mL洛伐他汀溶液,同时做对照实验(在转化培养培养2d后加入1mL洛伐他汀溶液) ,使其在培养基中的浓度为500μg/mL培养120h后,测定转化率。结果发现,底物诱导的转化率为38.16%,非底物诱导的转化率为37.14%。在进行微生物对洛伐他汀的类似物———美伐他汀(mevastatin)的转化,不同的菌株也不一样,如Streptomyces carbophilus需要底物诱导[5,6],而Actinomadurasp.对美伐他汀的转化则不需要底物诱导[7],而菌株ST2710对洛伐他汀的转化二者差别很小,说明不需底物诱导。
2.5　菌丝体和上清液对转化率的影响
　　菌株2710在种子培养基进行48h预培养后,接入转化培养基中培养48h后,将菌体和上清液离心分离,上清液中直接加入以二甲基甲酰胺溶解的洛伐他汀溶液,使其在培养基中的浓度为500μg/mL,菌体用Tris-HCl缓冲液(pH 7.2)洗涤后,加入100mL pH 7.2 Tris-HCl缓冲液中,再加入以二甲基甲酰胺溶解的洛伐他汀溶液,使其在培养基中的浓度为500μg/mL,两者均培养120h后,经微孔过滤,进行测定。结果见表2。
　　从表2可见,单一的菌丝体或上清液对洛伐他汀的转化作用明显低于对照,说明菌株ST2710对洛伐他汀的转化作用是在一系列酶的作用下完成的,这与Streptomyces carbophilus转化美伐他汀成普伐他汀的作用机理相似[6],。
3　结论
　　在上述培养条件下,用二甲基甲酰胺处理底物,转化率为最高。当在转化培养基中培养时间48h后;此时加入洛伐他汀溶液;继续培养120h后,转化率可达43.41%。
　　菌株ST2710对洛伐他汀转化作用是在胞内酶和胞外酶协同作用来完成的,并且不需要底物的诱导,这种转化作用的机理还有待进一步的研究。