微生物发酵法生产利巴韦林的初步研究
2007-11-22 23:25:12   来源：中国医药工业杂志   评论：0 点击：

利巴韦林(ribavirin，1)，化学名为1-β-D-呋喃核糖基-1H-1,2,4-三唑-3-甲酰胺，为广谱抗病毒药，临床用于治疗流行性感冒、小铁腺病毒肺炎、病毒性肝炎、呼吸道合胞病毒感染、急性角膜炎、结膜炎、流行性出血热和带状疱疹等[1]。目前主要有化学合成[2]、酶法合成[3]和发酵合成[4]等方法生产1，其中发酵法在国内尚未见报道。本研究在鸟苷(guanosine，2)生物合成途径的基础上利用其补救途径中的嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleosidephosphorylase，3)，催化2生成核糖-1-磷酸，再与前体物1,2,4-三唑-3-甲酰胺(1,2,4-triazole-3-carboxamide，4)反应合成1。

本研究主要考察4、MnSO4、温度、pH及培养基装量对1生物合成的影响。
1　仪器与材料
1.1　仪器与试剂
Agilent1100型液相色谱仪(安捷伦公司)；SBA-40C型葡萄糖-谷氨酸分析仪(山东省科学院生物研究所)。
1(江苏诚意药业有限公司，纯度98％)；4(湖北志诚化工科技有限公司，纯度99％)。
1.2　菌种与培养基
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TM903(本院代谢工程研究室诱变选育获得并保藏)。
斜面培养基/g·L–1：葡萄糖5，谷氨酸钠5，氯化钠2.5，蛋白胨1.0，酵母膏1.0，琼脂20；pH 7.0～7.2。121℃灭菌20min。种子培养基/g·L–1：葡萄糖25，谷氨酸钠6，蛋白胨8，酵母粉1.2，玉米浆1.5，NaCl 2.0，尿素3；pH 7.2。121℃灭菌10min。
发酵培养基/g·L–1：葡萄糖160，谷氨酸钠1.5，豆饼水解液35，药用酵母粉20，(NH4)2SO410，MgSO4·7H2O 4，K2HPO4·3H2O 6，MnSO4·H2O0.005，FeSO4·7H2O 0.02，CaCO3 20(140℃灭菌4h)；pH7.0，121℃灭菌15min。
2　方法与结果
2.1　培养方法
种子培养：取一环生长良好的TM903菌株接入装量为25ml/500ml摇瓶的种子培养基中，37℃振荡(160r/min)培养8～10h。发酵：以10%接种量接种于500ml装有不同量培养基的圆底三角瓶或挡板三角瓶中，37℃振荡(220r/min)培养60h，发酵结束后加水定容至原体积，取样测定1含量。
2.2　分析方法
菌体吸光度：用蒸馏水将发酵液稀释20倍(培养基中添加碳酸钙的体系用0.2mol/L盐酸稀释20倍)，摇匀，于620nm测定吸光度D620。
1：HPLC测定。色谱条件：色谱柱KromasilC18柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相乙腈-水(4∶96)，检测波长207nm，流速0.8ml/min。发酵液和1的色谱图见图1。残糖：采用葡萄糖-谷氨酸分析仪测定。
 

2.3　4添加量及添加时间的确定
4是合成1的前体物，其在培养基中的添加会影响1的积累，结果见图2。由图2可见，4的最佳添加量为10g/L，最佳添加时间是24h。若添加过早或过多，将会抑制菌体的生长，降低3的表达量，且不利于2的积累，从而
导致1产量降低；添加过迟或过少，将不能充分地起到前体诱导效应而合成1。
2.4　各因素对1合成的影响
2.4.1　MnSO4对1合成的影响
Mn2+可引起细胞形态变化，若适度控制培养基中Mn2+的含量，可改变细胞膜的渗透性，使3不断向胞外分泌；若Mn2+含量过高，则会抑制3向培养基的分泌[5]。据此研究了MnSO4的添加量及添加时间对1发酵的影响，结果见图3a。由图3a可见，在24h添加10mg/L MnSO4时菌体生长条件最佳，3表达量最大，发酵液中1产量可达

4.92g/L。当MnSO4添加过早时将抑制2的积累，添加过多则抑制3的胞外分泌，均导致1积累量减少。
2.4.2　温度控制对1合成的影响
据报道[6]，3的最适温度为65℃，因此考察了温度控制方式对1生成的影响。采用了4种温度控制方式：A—37℃恒温发酵；B—0～24h于37℃恒温发酵，24h后升温至48℃；C—0～24h于37℃恒温发酵，24h后每12h升高4℃；D—0～24h于37℃恒温发酵，24h后每6h升高2℃。结果见图3b。由图3b可见，方式D效果最佳，1能保持长时间的积累。而方式B和C由于温度提高幅度较大，菌体急速生长，提前进入衰亡期，前体物2积累量过少，导致1产量较低。
2.4.3　pH对1合成的影响
在菌体生长过程中，由于消耗葡萄糖产生的少量酸性中间代谢物会降低发酵液pH，影响菌体的正常代谢，从而影响发酵液中目的产物的积累。为防止发酵液中pH显著变化，可向培养基中添加化学缓冲体系或碳酸钙来调节发酵液pH[7]。由于在合成过程中需要磷酸盐参与代谢，因此，本研究比较了向培养基中添加磷酸缓冲液和碳酸钙对1积累的影响，结果见图3c。由图3c可见，添加磷酸缓冲液的发酵液pH在6.8～7.0内变化，且1产量较高。而添加碳酸钙的发酵液在发酵中期pH约为6.4，因碳酸钙与发酵液中酸性物质反应产生CO2，过量的CO2抑制菌体的糖代谢和呼吸[7]，从而导致产物1的积累量较少。因此采用磷酸缓冲液来控制发酵pH效果较佳。

2.4.4　培养基装量对1发酵的影响
在菌体生长阶段需氧量较高，但随着发酵进入1合成阶段，2进一步转化合成1过程中不需要NAD(P)H[3]，即不需要太高的溶氧。因此，在发酵过程中适当控制溶氧以满足生产菌的需求，以提高发酵产量。摇瓶发酵时，培养基的装液量与摇床转速基本上可以反映瓶内的溶氧水平。装液量越少，转速越大，则溶氧越好。据此，研究了发酵培养基装液量对1发酵的影响。
在500ml圆底三角瓶和带有挡板的三角瓶中分别装入20、25、30、35ml发酵培养基进行发酵，60h后测定发酵液中1含量，结果见表1。

由表1可见，挡板三角瓶的培养结果优于对应的圆底三角瓶，而同种三角瓶的装液量为25ml时1产量最高。
综上所述，1的最佳发酵条件为：在发酵培养到24h时添加10g/L 4和10mg/L MnSO4，此后每6h升温2℃，采用磷酸缓冲液调节控制pH，并采用装液量为25ml/的500ml挡板三角瓶于转速220r/min的摇床培养。从发酵0h起，每12h取样，测定各时间点的pH、菌体浓度、还原糖和1产量等发酵参数，绘制摇瓶发酵过程曲线，结果见图4。

由图4可见，TM903菌株在培养液中生长迅速，延滞期较短；在对数生长期，菌体生长较快，葡萄糖被迅速利用，pH缓慢下降；进入产物合成期即24h后，菌体浓度增加较慢，pH变化不明显，葡萄糖继续被消耗，1大量积累；在60h时1的浓度最高，为5.11g/L；在60h后，菌体开始自溶，残糖浓度为0，pH已经回升，发酵液中1的浓度逐渐降低。
3　讨论
枯草芽孢杆菌TM903培养24h时，添加适量的4以起到底物诱导效应；适时限量添加MnSO4有利于发酵过程中关键酶3及目的产物分泌至细胞外；添磷酸缓冲液可控制发酵过程中pH的变化，并提供1生产过程中所需的磷酸基团；逐步提高发酵温度有利于3催化能力的发挥，保证菌体正常代谢；发酵过程属于好氧发酵，为满足菌体生长及产物积累的需要，需适当控制氧的供给。
通过对微生物发酵法生产1的工艺条件进行研究，有望填补国内发酵法生产1的空白，同时为发酵法生产其它核苷类药物的研究提供参考。但由于利用发酵法生产1的研究还处于初步阶段，发酵水不高，距工业化生产还有较大距离。应进一步对枯草芽孢杆菌TM903进行菌种改造，提高其体内3的表达能力。