外循环气升式生物反应器气含率及其用于井冈霉素发酵的研究
2007-06-15 15:07:21   来源：中国卫生网   评论：0 点击：

生物反应器种类很多，特点各异，以不同的方式提供给细胞适宜的生长环境。生物反应器设计的主要目标是使产品的质量高、成本低。这就需要反应器的投资小、介质充分混合、氧传递速率高、能量消耗低。气升式生物反应器便是高效低能耗的一种。气升式生物反应器是利用喷射动能和流体在反应器内的重度差造成流体循环流动，从而实现培养液的搅拌、混合和溶氧。其特点为：结构简单、加工安装方便、密封性能好、染菌机会小、电耗低，是一种气搅拌生物反应器，具有机械搅拌生物反应器(通用式发酵罐)不可比拟的优点。因此，对各种形式的气升式生物反应器的开发研制和研究越来越多地引起各国专家和学者的重视，并在生物工程领域中的一些产品中得到了初步应用，如单细胞蛋白^［1］、维生素^［2］、氨基酸^［3］等。但是，综合国内外文献^［1～6］，将气升式生物反应器应用到抗生素发酵和带醪渣或粗粮发酵中的报道并不多见。

　　井冈霉素是吸水链霉菌井冈变种(S.hygrosco-picus var. jinggangensis Yen.)的代谢产物为氨基糖苷类抗生素^［7，8］。自1973年被发现以来，一直使用机械搅拌发酵罐发酵生产，功率消耗较大。若能用气升式生物反应器代替机械搅拌发酵罐，在井冈霉素发酵生产中得以应用，必将能降低生产成本，促进抗生素工业的发展，具有重要的现实意义。

　　本文通过对自制的不锈钢外循环气升式生物反应器气含率的试验研究，并将其应用到井冈霉素的发酵中，以考察其发酵性能，旨在为气升式生物反应器的推广应用提供一定的依据。

　　1　材料与方法

　　1.1　试验装置

　　外循环气升式生物反应器的总容积为11.5L，上升管与下降管的直径之比(D/d)为6.6，罐体高径比(H/D)为2.9，用不锈钢制造，通风量可调，温度可自动控制检测。其结构可参考文献^［9］。

　　与外循环气升式生物反应器作对比试验的机械搅拌生物反应，高径比为2.0，全容积为10L，三档平直叶搅拌器搅拌，转速、通风量可调，温度可自动控制检测。

　　上述两种生物反应器均可补料补油，并配有蒸汽发生系统、空气除菌系统。

　　1.2　菌种与培养

　　1.2.1　菌种　链霉菌井冈变种(S.hygroscopicus var. jinggangensis Yen.)，系本实验室保藏菌。

　　1.2.2　培养基及培养条件

　　斜面培养基及培养条件：葡萄糖1.0%，L-天冬酰胺0.05%，磷酸氢二钾0.05%，琼脂2.0%，pH7.0，灭菌接种后置恒温箱38～40℃下培养3～4d。

　　摇瓶种子培养：500ml三角瓶内装种子培养基40ml，其组成为：大米粉3.0%，豆饼粉2.2%，酵母粉1.0%，氯化钠0.2%，磷酸氢二钾0.08%，灭菌接种后，在回转式摇床上(回转速度200r/min)38～40℃下培养20～25h。

　　发酵罐发酵：发酵培养基组成为：玉米粉9.0%，豆饼粉4.0%，酵母粉0.5%，磷酸氢二钾0.1%，氯化钠0.1%，消沫油0.1%，经121℃、20min灭菌后，冷却到39±1℃，接入8%摇瓶种子液。发酵罐的培养条件为：罐压0.05MPa，通风量：气升式1∶1.1vvm，机械搅拌式1∶0.8vvm，搅拌转速300r/min，温度39±1℃，培养时间45h。

　　1.3　分析和测量方法

　　总糖和还原糖采用DNS试剂比色法测定；总氮采用凯氏定氮法测定；井冈霉素效价采用分光光度法测定；pH采用精密试纸测定；氨基氮采用甲醛法测定；气含率采用高度法测定。

　　2　结果与讨论

　　2.1　外循环气升式生物反应器气含率

　　对于气-液-固多相反应设备，气含率是表征流体力学的关键参数，它影响了气液两相流动和气泡上升速度。本文实验以空气作为气相，水、羧甲基纤维素钠(CMC)水溶液为液相，同时以空气-水体系作为基准进行比较，采用NDJ-4型旋转粘度计测定不同CMC浓度下的液相粘度。影响气含率的因素很多，本文主要研究通风量、装料量、粘度、罐内压力对气含率的影响，结果如图1～7所示，其中图1、图5～7是在空气-水物系中得到的结果。

图1　　不同装料量下气含率与通风量的关系

　　1：Vl=8.5L；　2：Vl=9.0L；　3：Vl=9.5L

图2　　不同粘度下气含率与通风量的关系

　　(Vl=9.01L)

　　1：μ=20mPa·S；　2：μ=30mPa·S；

　　3：μ=40mPa·S；　4：μ=50mPa·S

图3　　不同粘度下气含率与通风量的关系

　　(Vl=8.5L)

　　1：μ=20mPa·S；　2：μ=30mPa·S；

　　3：μ=40mPa·S；　4：μ=50mPa·S

图4　　气含率与粘度的关系

　　1：Vg=400L/h(Vl=8.5L)；　2：Vg=800L/h(Vl=8.5L)；

　　3：Vg=400L/h(Vl=9.0L)；　4：Vg=800L/h(Vl=9.0L)；

　　5：Vg=600L/h(Vl=8.5L)；　6：Vg=1000L/h(Vl=8.5L)；

　　7：Vg=600L/h(Vl=9.0L)；　8：Vg=1000L/h(Vl=9.0L)

图5　不同通风量下气含率与装料量的关系

　　1：Vg=400L/h；

　　2：Vg=600L/h；

　　3：Vg=800L/h

图6　　不同装料量下气含率与罐内压力的关系

　　1：Vl=8.5L；　2：Vl=8.75L；

　　3：Vl=9.0L

图7　　不同通风量下气含率与罐内压力的关系

　　1：Vg=1000L/h　2：Vg=800L/h；

　　3：Vg=600L/h

　　从图中可以看出：

　　(1)在同一装料量下，随着通风量的增加，气含率随之增加，在高通风量下气含率的变化趋势减缓，当通风量在800L/h之下时，气含率随通风量几乎呈线性变化；实验中还观察到，在高通风量的情况下，反应器上部气液两相分离明显，两相流动不稳定；

　　(2)料液粘度的增大将引起气含率的减小，通风量越高，减小的趋势越明显；从图2～4可以看出，通风量对高粘度流体中的气含率影响比对低粘度流体的影响小，主要原因在于流体粘度的增加导致阻力增大，流体流动特性差，使得气含率减小；

　　(3)在低装料量下，气含率水平较差，主要是由于气液循环不好；而在高装料量下，气液中的气含率也降低，主要是由于装料量大，静液高度高，流体阻力大的缘故；

　　(4)罐内压力增加，气含率减小，在罐内压力较大的情况下，装料量改变对气含率影响较小；在同一装料量下，通风量越小，罐内压力对气含率影响变化趋势越平缓；

　　(5)在同一通风量条件下，气含率随装料量的变化出现一个最大值，即就是说有一个最合适的装料量。从本实验的范围看，装料量以8.5～8.75L为宜，且高通风量下的最适装料量偏向此范围的上限。

　　对以上影响因素作计算机回归处理，得到关于气含率的关联式：

　　ξ=6.807×10²Vg^1.186V_L^-4.837μ^-0.126P^-0.689

　　此关联式是在模拟生物流体(空气不同浓度的CMC水溶液)的实验条件下得到的。针对物性相似的流体体系，在实验范围内，对外循环气升式生物反应器的放大设计有一定的参考价值。

　　2.2　外循环气升式生物反应器井冈霉素发酵

　　进行了反应器气含率的试验研究后，本文在外循环气升式生物反应器上进行井冈霉素发酵试验，以验证本反应器带醪渣或粗粮发酵的可能性。从气含率的研究可知，本反应器最适装料量为8.5L左右，因此本文分别选定装料量为8.0、8.5、8.75、9.0L，通风量为1∶1.0、1∶1.1、1∶1.2、1∶1.3vvm，结果表明装料量为8.75L、通风量为1∶1.1vvm为最好。为了比较外循环气升式生物反应器与机械搅拌生物反应器发酵性能的优劣，在进行气升式生物反应器发酵的同时，进行了机械搅拌发酵罐井冈霉素的发酵。发酵结果如图8和图9所示。

　　从图中可以看出，气升式生物反应器发酵曲线与机械搅拌生物反应器的发酵曲线基本相似。

　　从糖的变化曲线可以看出，在发酵初期，培养基中总糖下降非常迅速，这是由于当种子加入发酵罐后，菌丝体大量繁殖，从而使得大量的糖被消耗；而在发酵后期，总糖下降的趋势减缓，这主要是由于此阶段碳源主要用于井冈霉素的合成。还原糖的变化曲线与总糖的变化曲线相似。

　　由氨基氮变化曲线可知，在发酵前期，氨基氮浓度下降迅速，这主要是由于在此其间菌体浓度急剧增加；而在发酵中后期，由于原料中的蛋白质消耗接近结束，而又处于井冈霉素合成阶段，则表现为氨基氮浓度下降幅度减小。

　　试验结果表明，经过45h的发酵，气升式生物反应器的空气喷嘴直径1.5mm时，井冈霉素的发酵效价19975u/ml， 空气喷嘴直径为3.0mm时，井冈霉素的发酵效价为18950u/ml，而机械搅拌发酵罐中的井冈霉素效价为19630u/ml。由此可见，气升式生物反应器用于井冈霉素生产的发酵性能基本上可与机械搅拌式发酵罐相持平。因此，以本文的结果为基础，对外循环气升式生物反应器进行工程放大研究和工艺条件的探索，将是非常有价值的。

图8　　气升式生物反应器井冈霉素发酵曲线

　　1：井冈霉素效价；2：氨基氮；

　　3：pH；　4：总糖；　5：还原糖

图9　　　机械搅拌生物反应器井冈霉素发酵曲线

　　1：井冈霉素效价；2：氨基氮；

　　3：pH；　4：总糖；　5：还原糖

　　目前，我国发酵行业中所用的生物反应器，大多是机械搅拌生物反应器，对新型气升式生物反应器的研制和开发，并对微生物发酵性能进行考察，对促进我国生物技术的发展和发酵工业的设备挖潜以及技术改造都具有十分重要的意义和价值。

　　浙江省自然科学基金资助项目，文号：398027

　　郑裕国，男，生于1961年，硕士，副教授。

参考文献

　　1，夏林聪，高孔荣. 外循环气升式反应器性能及其应用于大米酒糟废液处理的研究. 生物工程学报，1991；7(4)：359

　　2，章学钦，夏杰，屠天强等. 环隙气升式反应器的开发 Ⅱ.维生素C两步发酵过程. 华东化工学院学报，1992；18(6)：742

　　3，张文会，高孔荣. 内循环气升式发酵罐的特性及其应用于谷氨酸发酵的研究. 生物工程学报，1993；9(2)：170

　　4，吴鹏，甘一如，胡宗定. 低高径比喷射双环流生化反应器流体力学和发酵性能的研究. 生物工程学报，1995；11(2)：190

　　5，Bello R A, Robinson C W, Moo-Young M. Gas holdup and overall volumetric oxygen transfer coefficient in airlift con-tactors. Biotechnol Bioeng，1985；27：369

　　6，Kamp F, Wase D A J, McManamey W J, et al. A comparison of some methods of estimating volumetric masstransfer coefficients in an external-loop airlift fermenter. Biotechnol Bioeng，1987；30：179

　　7，上海农药研究所农抗组. 井冈霉素. 上海：上海人民出版社，1977：1

　　8，上海农药研究所农抗组. 井冈霉素产生菌的鉴定. 微生物学报，1975；15(2)：110

　　9，郑裕国，汪钊，陈小龙. 内置筛板外循环气升式生物反应器中液相循环时间的研究. 中国抗生素杂志，1999；24(2)：105