化妆品用人表皮生长因子的离子交换法纯化和脱色工艺研究
2006-09-17 16:22:44   来源：不详   评论：0 点击：

0 　引 　言
   人表皮生长因子是一条具有 53 个氨基酸残基、分子量约为 6,200 的单链多肽 ,能够刺激许多类型的细胞增殖 ,促进蛋白质和 RNA 合成 ,抑制胃酸分泌 ,在医药和化妆品行业具有广泛的应用.基因重组技术使人表皮生长因子的大批量生产成为可能 ,并且许多研究已经陆续解决了重组人表皮生长因子(rhEGF) 大批量生产过程中所遇到的技术难题[1].但是这些研究注重上游过程 ,关于下游过程的研究还很不充分[5].事实上 ,rhEGF 的大批量纯化依然是一个技术难题 ,因为发酵液中存在许多异质蛋白 ,它们的物理和化学阵质同rhEGF非常接近[4].不同的应用需要不同纯度的rhEGF ,中等纯度的rhEGF可以满足化妆品的使用要求.产品越纯 ,生产成本越高.操作方便、成本低廉和产品纯度中等的 rhEGF纯化工艺能够降低价格 ,扩大应用 ,提高生产商的竞争能力.现有的 rhEGF 纯化工艺基本上以生产高纯度和医药用产品为目的 ,过程复杂、收率低下[4] ,所以 ,开发满足化妆品使用要求的rhEGF 纯化工艺非常必要.当然 ,纯度低的rhEGF含有更多的异质蛋白 ,而某些异质蛋白是色素 ,如果不经脱色处理 ,则产品色泽深暗 ,其应用将大受限制.因此 ,对于中等纯度 rhEGF的脱色显得尤为重要 ,但是 ,迄今未见相关的研究报道.
     rhEGF纯化工艺一般由离子交换、凝胶过滤、亲和色谱和反相高效液相色谱等单元操作组成[4,5 ].比较而言 ,离子交换具有收率高、产量大的优势[6] .本文报道应用离子交换技术所开发的、以生产满足化妆品使用要求为目的的 rhEGF纯化和脱色工艺.
1材料与方法
1.1材料
    rhEGF发酵液经离心、盐析和透析，所得透析液的rhEGF质量浓度为1.3-1.6 g/ L.
    纯化用弱碱性离子交换树脂选用DEAE Seph-adex-A50(瑞典Amersham Pharmacia公司).脱色用弱碱性离子交换树脂选用D314杭州争光树脂有限公司).
    离子交换树脂用二次蒸馏水冲洗，再用2倍体积的乙醇浸泡2-3 h，同时不断地搅拌，以除去杂质并使之完全溶胀.用二次蒸馏水冲洗至没有乙醇的气味，然后缓慢地装入充满二次蒸馏水的玻璃柱中，直至一定高度.
    纯化和脱色过程在分别充填DEAE Sephadex-A50和D314，内径为16 mm的玻璃柱(以下分别简称纯化柱和脱色柱)中进行.
1. 2 rhEGF，浓度检测
    采用双抗体夹心式酶联免疫吸附法定量检测rhEGF浓度L11]，试剂盒为Pep ro Tech公司的产品(human EGF ELISA Development Kit， Catalog No900- K05).
1.3色度检测
    因为色素的多样性和复杂性，迄今尚无专门的色度检测方法.本文采用分光光度法，波长选择430nm[8] ,色度为
     D = 1.147 ×10 2 A430 　( R2 = 0.998 3)式中 ,A430为 430 nm 下的吸光度.

1.4 　纯 　化
      一定量的 rhEGF 透析液进样到纯化柱 ,由含NaCl (0.5 mol/ L) 的磷酸缓冲液 (p H = 7.4) 进行洗脱.分段收集纯化洗脱液 ,检测其 rhEGF 浓度.比较rhEGF 收率 ,考察纯化操作条件的影响.rhEGF 收率计算式为
     R Y = (rhEGF 浓度纯化后/ rhEGF 浓度纯化前) ×100 %
1.5 　脱 　色
      rhEGF 纯化洗脱液由脱色柱进行脱色.分段收集脱色流出液 ,检测其色度和 rhEGF 浓度.比较脱色率和 rhEGF 收率 ,考察脱色操作条件的影响.脱色率计算式为
D C = [ (1 - A430脱色后 ) / A430脱色前 ] ×100 %
2 　结果与讨论
2.1 　纯 　化
2.1.1 　流速的影响
      当 rhEGF 透析液进样体积为 80.0 mL 、纯化柱床高为 10.0 cm 时 ,洗脱液流速对 rhEGF 收率的影响如图 1 所示.洗脱液流速快 ,rhEGF 收率低 ,这说明:hEGF与DEAE Sephadex A50的离子交换容易而快速.低流速洗脱有利于rhEGF浓缩，但降低生产效率，当洗脱液流速低于150.0 mL/ h时，rhEGF收率就高于85%.

2.1.2 　进样体积的影响
      当洗脱液流速为 150.0 mL/ h ,纯化柱床高为10.0 cm 时 ,rhEGF 透析液进样体积对 rhEGF 收率的影响如图 2 所示.进样体积小 ,离子交换容量相对较大 ,富余的交换容量与透析液中的杂质发生作用 , rhEGF收率较高.当进样体积增大，与DEAE Sephadex-A50结合能力弱的杂质因rhEGF的竞争而被交换下来 ,造成 rhEGF 收率下降.当进样体积小于80.0 mL 时 ,rhEGF 收率大于 85 %.

2.1.2 　床高的影响
      当洗脱液流速为 150.0 mL/ h ,rhEGF 透析液进样体积为 80.0 mL 时 ,纯化柱床高对 rhEGF 收率的影响如图 3 所示.床高低于 10.0 cm 的时候 ,由于离子交换容量小 ,不能满足回收 rhEGF 的要求 ,其影响非常显著.而离子交换容量基本能够满足回收 rhEGF 的要求时(床高大于 10.0cm) ,床高就没有什么影响了.

2.2 　脱 　色
2.2.1 　流速的影响
       纯化洗脱液的pH=5.0,脱色柱床高为7.5cm ,流速对脱色的影响如图 4 所示.脱色率在低流速时(小于 60.0 mL/ h)下降得相对比较慢 ,高流速时(大于 80.0 mL/ h)下降很快;而 rhEGF 收率在低流速时(小于 60.0 mL/ h)急剧增大 ,高流速时(大于 60.0 mL/ h)缓慢下降.这是因为流速低时 ,色素和 rhEGF 与 D314 的接触时间长的缘故.

2.2.2 　p H 值的影响
      脱色率和 rhEGF 收率受色素、rhEGF 和 D314的电荷状态的影响 ,而 p H 值改变它们的电荷状态 , 因而改变脱色率和 rhEGF 收率.流速为 60.0 mL/h ,脱色柱床高为 7.5 cm ,rhEGF 纯化洗脱液的 p H 值对脱色的影响如图 5 所示.随着 p H 值的增大 ,脱色率先增后降 ,p H = 7.0 是转折点 ,其原因应该是: 色素和 D314 在酸性条件下都是阳离子 ,由于相同电性的排斥作用 ,彼此难以接近.随着 p H 值的增大 ,色素转化为阴离子 ,所以脱色率增大.当 p H 值   进一步增大时 ,D314 的离解受到抑制 ,脱色率因之下降.随着 p H 值的增大 ,rhEGF 收率却先降后增 ,   转折点在 p H = 6.5.rhGEF 的等电点为 4.6[9 ,当 p H 值超过 4.6 时 ,rhEGF 以阴离子状态存在 ,容易被 D314 所交换 ,所以 rhEGF 收率开始快速下降.同样 ,当 p H 值进一步增大时 ,D314 的离解受到抑制,rhEGF 收率因之上升.

2.2.3 　床高的影响
     在流速为 60.0 mL/ h 和 rhEGF 纯化洗脱液的pH为5.0的条件下 ,考察脱色柱床高对脱色的影响 ,结果如图 6 所示.随着床高的增大 ,脱色率上升 ,rhEGF 收率下降 ,这显然是因为 D314 的离子交换容量随着床高增大而增大的缘故.

3结论
    rhEGF透析液在流速为150.0 mL/ h、进样体积为80.0 ML和纯化柱床高为10.0 cm的条件下，经DEAE Sephadex A50纯化柱处理和真空冷冻干燥，所得产品纯度为32 %,rhEGF收率为85 %.但产品呈黄色，不能满足化妆品行业的使用要求.
    rhEGF纯化洗脱液在流速为60.0 mL/h,pH为5.0和脱色柱床高为7.5 cm的条件下，再经D314脱色柱处理和真空冷冻干燥，所得产品纯度为32 %,rhEGF收率为80%.产品色泽为白色或浅黄色，能够满足化妆品行业的使用要求.
    据此，我们设计了一条以生产满足化妆品使用要求为目的的rhEGF纯化和脱色工艺，总rhEGF收率超过53%产品纯度高于32%:
    rhEGF发酵液-->离心-->盐析-->透析-->DEAESephadex A50离子交换-->D314离子交换-->真空冷冻干燥-->产品
    离子交换是合适的化妆品用rhEGF纯化和脱色技术，D314是良好的脱色剂.