灵芝菌发酵液制剂中灵芝多糖及总糖含量测定
2007-11-13 10:26:49   来源:时珍国医国药   评论:0 点击:

   灵芝为多孔菌科植物灵芝Ganoderma lucidum (Leyss.ex.Fr.) Karst.的干燥子实体,在中医临床应用已有悠久的历史。近代灵芝菌丝体与发酵液的充分利用,为灵芝开辟了一条新的药用途径。化学分析、药效学试验和临床应用均获得与灵芝子实体相似的结果,并具有生产周期及培养条件可严格控制、适于工厂规模化生产的特点。临床上已有灵芝菌片和灵芝菌液等制剂广泛应用。目前,有关灵芝菌制剂的含量测定方法尚未见报道。灵芝多糖近年来被认为灵芝扶正固本的重要有效成分[1]。为保证灵芝菌制剂的临床疗效,进一步控制制剂质量,本文采用分光光度法测定了灵芝菌液及灵芝菌片中总糖及灵芝多糖的含量,方法简便快速,灵敏度高,重现性好,可作为灵芝菌质量及工艺的控制方法。
1 仪器与试药
UV-265 FW分光光度计(日本岛津);PE-1720红外分光光度计(美国);苯酚、硫酸、乙醇等试剂均为分析纯。葡萄糖对照品由中国药品生物制品检定所提供。市售灵芝菌液及灵芝菌片由泰安四维制药股份有限公司生产。
2 灵芝菌液及灵芝片中灵芝多糖的含量测定
2.1 比色条件的选择
2.1.1 最大吸收波长的确定:分别取经硫酸苯酚显色后的无水葡萄糖对照液,灵芝菌液供试品液;以空白液作空白对照,于400~580 nm波长间进行测定,结果见图1。对照品溶液和样品供试液在490 nm波长处具有最大吸收。

 

  此外,将样品供试液烘干,灵芝多糖红外图谱与文献报道基本一致。结果见图2。

2.1.2 显色稳定性:灵芝菌液供试液显色后,通过测定不同时间的吸收度,结果表明显色以时间在2 h内吸收度稳定。
2.1.3 精密度考察:对葡萄糖对照品及灵芝菌液供试液,分别进
行6次测定,计算其相对标准偏差,结果RSD分别为0.01%和0.02%。
2.1.4 重现性实验:对同一批号同时制备的6份灵芝菌液供试液,测定其含量,计算平均值,RSD=1.14%。
2.2 对照品溶液的制备及标准曲线的绘制
2.2.1 对照品溶液的制备:精密称取在105℃干燥至恒重的无水
葡萄糖10 mg,置100 ml量瓶中,加水适量使溶解,并稀释至刻度摇匀,即得。
2.2.2 标准曲线的绘制:精密吸取对照品溶液0.0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 ml分别置10 ml量瓶中,分别加水至1 ml,精密加入5%苯酚溶液1.5 ml,缓缓滴加浓硫酸7.5 ml,立即混匀,冷却至室温,放置20 min,在490 nm波长处测定吸收度。以吸收度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。其回归方程为:Y=142.67X-0.530,相关系数γ=0.999 5。
2.3 灵芝多糖的提取分离
2.3.1 不同提取时间对灵芝多糖含量测定的影响:精取灵芝菌液

10 ml,置50 ml圆底烧瓶中;另取灵芝菌片,除去糖衣,研细,精取0.35 g,置50 ml圆底烧瓶中,分别加入20 ml水,置水浴上,回流提取1,2,3 h。精取上述提取液各2 ml,分别加入乙醇20 ml,混匀,离心,弃去上清液,残渣加水分别转移至25 ml量瓶中,加水稀释至刻度,振摇,滤过,弃去初滤液,精取各续滤液1 ml置10 ml量瓶中,自“精密加入5%苯酚溶液1.5 ml”起,按2.2.2项下操作,测定。结果见表1。

 

表1结果表明,灵芝菌液为灵芝发酵液经匀浆而成,因此提取时间对灵芝多糖含量无影响,可直接取样测定;灵芝菌片提取2 h灵芝多糖即可提取完全。
2.3.2 不同加醇量对含量测定的影响:实验结果见表2。

2.3.3 灵芝菌液及灵芝菌片中灵芝多糖的含量测定:按上述方
法,对2种制剂进行灵芝多糖含量测定,结果见表3。
3 灵芝菌液及灵芝菌片中总糖测定
精称灵芝片细粉0.5 g,置50 ml圆底烧瓶中,精密加入50 ml水,精密称重,加热回流2 h,放冷,补足溶剂至原重量;精密吸取灵芝菌液3 ml,置50 ml量瓶中,加蒸馏水稀释至刻度,摇匀;取上述两种样品,滤过,弃去初滤液,精取续滤液25 ml,置50 ml量瓶中,加水稀释至刻度,混匀,精取1 ml置10 ml量瓶中,精密加入新鲜配制的5%苯酚溶液1.5 ml,余下按2.2.2标准曲线制备项下方
法依法操作,测定吸收度,从标准曲线上读出供试品溶液中对应葡萄糖的量,计算,结果见表3。

4 结果与讨论
4.1 实验结果表明,灵芝菌液及灵芝菌片中灵芝多糖含量与文献报道基本一致[2]。由于目前有关灵芝子实体、灵芝菌丝体及发酵液中灵芝多糖的生成转化机理尚未见报道。因此,灵芝子实体及其制剂多采用测定总糖来控制质量;考虑灵芝菌发酵液中尚有培养基残存葡萄糖等因素的干扰,采用测定灵芝多糖作为检测指标,较为客观、合理。
4.2 本实验灵芝多糖测定方法的原理是先用80%乙醇沉淀去掉单糖、低聚糖、甙类及生物碱等干扰成分,再用水提取灵芝多糖。灵芝在硫酸的作用下,先水解成单糖分子,并迅速脱水先生成糖醛衍生物,然后和苯酚合成橙色化合物,与无水葡萄糖的显色液颜色一致,以比色法测定其含量,该方法简单可靠,重现性好,显色稳定,多糖水解完全。可作为灵芝发酵菌丝体及其制剂的含量测定方法。本法灵敏度高,仪器简单,但整个实验操作必须规范,否则影响实验结果。



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