甘露糖蛋白对葡萄酒苹果酸-乳酸发酵的影响
2007-04-27 19:43:37   来源：西北农林科技大学学报(自然科学版)   评论：0 点击：

　　糖蛋白是自然界分布最广的一类复合糖,越来越多的证据表明,几乎所有的细胞都能合成糖蛋白[1-2]。糖蛋白是由多糖和蛋白质以共价键连接而成的复合糖(又叫结合蛋白质),多糖部分一般不超过15个单糖基[1,3-4]。酵母多糖蛋白(复合多糖,主要是甘露糖蛋白)来自酵母细胞壁,酵母细胞壁占酵母质量(干)的15%～25%,由多糖(90%)、蛋白质、脂类等组成,其具体组份与酵母品种有关[1,3,5]。对从白葡萄酒中分离并经阴离子交换柱纯化得到的甘露糖蛋白进行分析发现,甘露糖蛋白的分子质量约为420ku,含碳水化合物70%,蛋白质30%。其中碳水化合物中98%是甘露糖,2%是葡聚糖。蛋白质部分主要由丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸和丙氨酸构成[3]。

        甘露糖蛋白有利于葡萄酒中蛋白和酒石的稳定[1,4,6-9],对红葡萄酒中香气和多酚物质产生影响,削弱单宁的收敛性和尖刻感,提高酒的饱满肥硕感[4,9-11];对起泡葡萄酒的瓶内发酵、静止葡萄酒的桶内陈酿和雪利酒的生产有促进作用[1,9,12]。自然条件下,用可以产生较多甘露糖蛋白的酵母菌株发酵的葡萄酒,其苹果酸-乳酸发酵(MLF)比用产生较少甘露糖蛋白的酵母菌株发酵的葡萄酒要启动得快,由此可以推断,以甘露糖蛋白为主的多糖可有效促进乳酸菌的生长,加快MLF的启动和进行[7]。现代葡萄酒酿造工艺中,葡萄酒的MLF是一个非常重要的工艺环节,尤其是红葡萄酒,基本上都要进行MLF,一些白葡萄酒也采用类似的工艺[12]。通过葡萄酒的MLF,可以改善葡萄酒的口感和香气,降低葡萄酒的总酸,提高酒的微生物稳定性[13]。但葡萄酒MLF要求的条件比较严格,如要求合适的温度、合适的pH值等,而且酚类物质含量较高的葡萄酒的MLF也不易进行,给葡萄酒的实际生产带来不便。

本试验向2004年生产的、刚刚结束酒精发酵的晚红蜜干红葡萄酒中添加一定量的甘露糖蛋白,研究其在常温、低温、低pH、高酚类物质含量等不同条件下,对不同菌种葡萄酒MLF的影响,以期解决葡萄酒生产中遇到的MLF问题。

1　材料与方法

1.1　材料与仪器

1.1.1　材料　五倍子酸(gallicacid)和分析纯酒石酸(tartaricacid)。甘露糖蛋白,来源于法国Lalle-mand公司。葡萄酒,刚结束酒精发酵的晚红蜜干红葡萄原酒,酒精度11.5%(体积分数),干浸出物19.5g/L,总SO237mg/L,游离SO23mg/L,总酸9.7g/L(以酒石算计),总糖3.8g/L,总酚4.1g/L,挥发酸0.5g/L,pH值3.28。3种商品乳酸菌:a.Lalvin31MBR(Oenococcusoeni.)法国LALLE-MANDS.A.公司生产;b.V.D(Leuconostoconos.),法国LALLEMANDS.A.公司生产;c.VinifloraOENOS(Leuconostoconos.),丹麦Chr.Hansen公司生产,是一种经特殊工艺加工的颗粒状、可悬浮、直投式干乳酸菌。

1.1.2　仪器　层析缸,沃特曼层析滤纸,大恒温水浴锅,恒温箱,酸度-pH测定仪。

1.2　方　法将葡萄酒用灭菌纱布过滤去掉大颗粒杂质后,分装入3个10L可密封的玻璃瓶中。玻璃瓶密封后放入80℃恒温水浴锅中恒温加热2h,以杀灭葡萄酒中的微生物。取出酒瓶自然降温至室温,取样检测样品的理化指标,用纸上层析法检测样品MLF情况。在3个玻璃瓶中分别按推荐量加入3种不同的乳酸菌,接种菌数均为106/mL,其中乳酸菌a和b的添加量为1g/hL,乳酸菌c的添加量为0.64g/hL。加入乳酸菌充分溶解并搅拌均匀后,分装到375mL无色葡萄酒瓶中备用。

1.2.1　20℃条件下添加甘露糖蛋白对原葡萄酒MLF进程的影响　对照组为3瓶分别加入不同乳酸菌的酒样,试验组为3瓶分别加入不同乳酸菌后,再加入200mg/L甘露糖蛋白的酒样。将甘露糖蛋白直接加入酒样瓶中后,充分摇动酒瓶,使甘露糖蛋白充分溶解并均匀分布,然后放入20℃恒温箱中保温。试验设2个重复,用纸上层析法每天检测1次MLF进程,根据每个样品中的苹果酸和乳酸在层析纸上色斑的大小和色度,粗略估计苹果酸和乳酸的量及比例[14]。将MLF进程分为10个级别,0为无乳酸色斑,10为无苹果酸色斑。

1.2.2　15℃条件下添加甘露糖蛋白对葡萄酒MLF进程的影响　将试验酒样放入15℃的恒温箱中保温,用纸上层析法每4天检测1次MLF进程,其他试验处理方法与1.2.1相同。1.2.3　原葡萄酒调整pH值后在20℃条件下添加甘露糖蛋白对MLF进程的影响　用质量分数10%的酒石酸溶液将原葡萄酒样品的pH值调整到3.10,用纸上层析法每2天检测1次MLF进程。其他试验处理方法与1.2.1相同。1.2.4　加入五倍子酸后在20℃条件下添加甘露糖蛋白对葡萄酒MLF进程的影响　按2.0g/L的量向葡萄酒中加入五倍子酸,用纸上层析法每2天检测1次MLF进程。其他试验处理方法与1.2.1相同。

2　结果与分析

2.1　干红葡萄原酒加热灭菌后的理化指标　　干红葡萄原酒加热灭菌后,经纸上层析测定,MLF进程为0;样品理化指标测得值为:酒精度11.4%(体积分数),干浸出物19.5g/L,总SO235mg/L,游离SO24mg/L,总酸9.7g/L(以酒石酸计),总糖3.8g/L,总酚4.05g/L,挥发酸0.5g/L(以乙酸计),pH值为3.3。与未经加热处理的酒样相比,基本没有变化。2.2　20℃条件下添加甘露糖蛋白对葡萄酒MLF的影响　　试验结果表明,所有处理的MLF均在13d内全部完成,各处理的MLF进展情况见表1。

2.2.1　20℃条件下3种乳酸菌的发酵能力　由表1可知,加入乳酸菌a的酒样,MLF进程于第4天达到10%,第12天发酵结束;加入乳酸菌b的酒样MLF进程于第4天达到10%,第13天发酵结束;加入乳酸菌c的酒样第3天发酵进程达到10%,第11天发酵结束。3种乳酸菌都可以很快启动MLF,并且在相对较短的时间内完成发酵。相比较而言,乳酸菌c的发酵启动较快,发酵时间也较短,发酵能力较a和b稍强,乳酸菌a和b的发酵能力相当。

2.2.2　20℃条件下添加甘露糖蛋白对MLF启动的影响　由表1可知,向加入乳酸菌a或b的酒样中加入甘露糖蛋白后,第3天MLF完成10%,均比CK提前1d;加入甘露糖蛋白和乳酸菌c的酒样于第2天MLF完成10%,也比CK提前1d。说明在其他条件相同的情况下,对于不同的乳酸菌,甘露糖蛋白都可以加快MLF的启动。

2.2.3　20℃条件下添加甘露糖蛋白对MLF进程的影响　所有酒样在MLF启动以后,发酵进程都很迅速,都在较短的时间内完成了MLF。加入甘露糖蛋白和乳酸菌a的样品在第9天完成了MLF,比CK提前3d,是CK用时的75%;加入甘露糖蛋白和乳酸菌b的样品在第8天完成了MLF,比CK提前5d,是CK用时的62%;加入甘露糖蛋白和乳酸菌c的样品在第7天完成了MLF,比CK提前4d,是CK用时的64%。由此可以得知,加入甘露糖蛋白以后,极大地加快了MLF的进程,发酵时间平均大约缩短了1/3。

2.3　14℃条件下添加甘露糖蛋白对葡萄酒MLF的影响　　与20℃相比,14℃下葡萄酒的MLF进程非常缓慢,所用时间大约是20℃下的4倍。尽管如此,所有样品的MLF最终都能完成,最长用时48d(表2)。

2.3.1　14℃条件下3种乳酸菌的发酵能力　对表1和表2中结果进行对比分析可知,14℃下葡萄酒MLF的启动较20℃下困难,只加入乳酸菌a或b的处理,在14℃下的发酵进程达到10%的用时增加为20℃下的4倍,为16d。加入乳酸菌c的处理发酵启动较快,用时相对较短,于第8天发酵进程达到10%。14℃下葡萄酒MLF的进程也很慢,只加入乳酸菌a或b的酒样用时48d才能完成MLF,只加入乳酸菌c的酒样用时44d才能完成MLF。说明在低温情况下,尽管乳酸菌c处理发酵启动较快,但完成发酵用时与加入乳酸菌a或b的处理基本相同,没有太大差异。

2.3.2　14℃条件下添加甘露糖蛋白对MLF启动的影响　由表2可知,以乳酸菌a或b发酵的酒样,加入甘露糖蛋白后第8天MLF完成10%,与只加入乳酸菌a或b的处理相比,均提前8d;加入甘露糖蛋白和乳酸菌c的酒样第4天MLF完成10%,比CK提前4d。说明在14℃条件下,对于不同的乳酸菌,甘露糖蛋白都可以加快葡萄酒MLF的启动,而且效果明显。2.3.3　14℃条件下添加甘露糖蛋白后对MLF进程的影响　由表2可知,加入乳酸菌a和甘露糖蛋白的酒样,于第40天完成了MLF,比CK提前8d,是CK用时的80%;加入乳酸菌b和甘露糖蛋白的酒样,于第36天完成了MLF,比CK提前12d,是CK用时的75%;加入乳酸菌c和甘露糖蛋白的酒样,第32天完成了MLF,比CK提前12d,是CK用时的73%。表明在相对较低的温度条件下,向葡萄酒中加入甘露糖蛋白,也可以有效加快其MLF进程,较其对照平均大约缩短发酵时间1/4。

2.4　葡萄酒调整pH值后在20℃条件下添加甘露糖蛋白对MLF的影响　　pH值是影响MLF进程最重要的限定性因素,当葡萄酒的pH值在3.1以下时,葡萄酒MLF的启动有时会很困难[2,4,7]。结合表1和表3可知,将样品的pH值调整到3.10后,所有样品的苹果酸-乳酸发酵用时都比调整前延长了10d以上。

 2.4.1　降低pH值对3种乳酸菌发酵能力的影响　对比表1和表3结果可以发现,降低葡萄酒的pH值后,其苹果酸-乳酸发酵启动变得困难,只加入乳酸菌a或b的处理发酵进程达到10%的用时较未调整pH值前增加了4d。但降低pH值对乳酸菌c的发酵启动影响要小一些,其于第4天发酵进程达到10%,仅比未调整pH值的样品晚1d,说明乳酸菌c比较适合于pH值较低的葡萄酒的MLF。降低葡萄酒的pH值后,其MLF进程相对减慢,只加入乳酸菌a或b的酒样用时28d才可完成MLF,分别比不调整pH值多用时16和15d,再次证明2种乳酸菌的发酵力没有大的区别。只加入乳酸菌c的酒样用时22d完成MLF,比不调整pH值多用时11d。说明在低pH值条件下,乳酸菌c的启动较快,发酵力也较强。

2.4.2　降低pH值后添加甘露糖蛋白对MLF启动的影响　由表3可知,降低pH值后,加入乳酸菌a和甘露糖蛋白的酒样于第6天MLF完成10%,比CK提前2d;加入乳酸菌b和甘露糖蛋白的酒样第4天MLF完成10%,比CK提前4d;加入乳酸菌c和甘露糖蛋白的酒样第4天MLF完成10%,与CK同步。说明在低pH值条件下,甘露糖蛋白可以有效地加快乳酸菌a和b的MLF启动,而对乳酸菌c的效果不明显。

2.4.3　降低pH值后添加甘露糖蛋白对葡萄酒MLF进程的影响　由表3可知,降低pH值后,加入乳酸菌a或b和甘露糖蛋白的酒样,于第22或20天完成了MLF,分别比CK提前了6和8d,分别是CK用时的78%和71%;加入乳酸菌c和甘露糖蛋白的酒样,于第18天完成了MLF,比CK提前4d,是CK用时的82%。表明在相对较低的pH值条件下,加入甘露糖蛋白以后,可以有效地加快葡萄酒MLF的进程,平均大约缩短发酵时间1/5。

2.5　原葡萄酒中加入五倍子酸后在20℃条件下添加甘露糖蛋白对MLF进程的影响　　总酚含量的高低,往往会对葡萄酒的MLF产生很大的影响,有些总酚含量大于5.5g/L的红葡萄酒,其MLF的启动有时会比较困难[7]。向葡萄酒样中加入2g/L的五倍子酸调整其总酚含量后,酒样的MLF进程见表4。

2.5.1　提高葡萄酒总酚含量对3种乳酸菌发酵能力的影响　将表1和表4结果进行对比可知,提高葡萄酒总酚含量后,其MLF的启动稍慢,只加入乳酸菌a或b的处理发酵进程达到10%时用时比不调整总酚含量时增加了2d;提高总酚含量对乳酸菌c处理的发酵启动影响要小一些,发酵进程达到10%仅比不调整总酚含量的样品晚1d。提高葡萄酒总酚含量后,其MLF的进程也要慢一些,只加入乳酸菌a或b的酒样用时20d完成MLF,分别比不调整总酚含量多用时8和7d;只加入乳酸菌c的酒样用时16d完成MLF,比不调整总酚含量多用时5d。说明在总酚含量较高的情况下,葡萄酒的MLF启动受到了一定阻碍,发酵速度也受到了一定限制。

2.5.2　提高葡萄酒总酚含量后添加甘露糖蛋白对MLF启动的影响　由表4可知,提高葡萄酒总酚含量后,加入甘露糖蛋白和乳酸菌a或b的酒样,均于第4天MLF完成10%,均比CK提前2d;而加入甘露糖蛋白和乳酸菌c的酒样与其CK同时在第4天MLF完成10%。说明在葡萄酒总酚含量较高的情况下,甘露糖蛋白可以有效地加快乳酸菌a和b的MLF启动。对乳酸菌c的效果不明显的原因是,甘露糖蛋白与酒中的酚类物质结合并产生包裹作用,使得被结合和被包裹的这部分酚类物质不能与乳酸菌接触,从而削弱了酚类物质对乳酸菌的杀菌或抑菌作用。而且乳酸菌c被设计成颗粒状制剂,这种制剂本身就会对乳酸菌产生保护作用。

2.5.3　提高葡萄酒总酚含量后添加甘露糖蛋白对MLF进程的影响　由表4可知,提高酚类物质含量后,所有样品完成MLF用时都有所增加。加入甘露糖蛋白后,乳酸菌a或b处理均于第16天完成了MLF,均比CK提前4d,是CK用时的80%;加入甘露糖蛋白和乳酸菌c的处理,于第14天完成了MLF,比CK提前2d,是CK用时的88%。说明甘露糖蛋白可以有效促进总酚含量较高的葡萄酒的MLF。

3　结论与讨论

甘露糖蛋白是酵母细胞壁的主要成分之一。在葡萄酒的酒精发酵过程中,由于酵母的自溶作用,会有一部分甘露糖蛋白进入葡萄酒中,也可以人为地提取酵母甘露糖蛋白后再添加到葡萄酒中。以前的研究表明,甘露糖蛋白具有促进葡萄酒MLF的作用[8,12]。本试验研究了不同菌种在常温、低温、低pH、高酚类物质含量等不同条件下,向葡萄酒中添加一定量的甘露糖蛋白对葡萄酒MLF的影响。在20℃条件下添加甘露糖蛋白后,有促进葡萄酒MLF启动的作用,加入3种乳酸菌的酒样完成10%的发酵都比各自CK提前了1d。对不同的乳酸菌种或制剂,甘露糖蛋白对MLF进程的促进效果不尽相同。对加入乳酸菌a、b、c的酒样,加入甘露糖蛋白后,完成MLF比CK分别少用时3,5,4d。说明在正常条件下,加入甘露糖蛋白可以有效地缩短葡萄酒MLF的时间。在14℃的较低温度条件下添加甘露糖蛋白,加入乳酸菌a、b、c的酒样完成10%发酵分别比CK提前了8,8,4d;完成MLF分别比CK提前了8,12,12d。说明低温条件下,加入甘露糖蛋白可以促进葡萄酒MLF快速启动,并可有效缩短MLF的时间。在pH值较低情况下,甘露糖蛋白同样对葡萄酒MLF有很明显的促进作用。葡萄酒pH值调整到3.1后,在20℃的发酵条件下,向加入乳酸菌a、b、c的酒样中再添加甘露糖蛋白,其完成10%发酵分别比各自CK提前了2,4,0d;完成MLF分别比CK提前了6,8,4d。说明加入甘露糖蛋白可以有效加快酸度较高、pH值较低葡萄酒的MLF。葡萄酒中的酚类物质对乳酸菌有一定的抑制或杀菌作用,较高的酚类物质含量会抑制葡萄酒的MLF。由于甘露糖蛋白可以与葡萄酒中的酚类物质有效结合,所以甘露糖蛋白也可以有效促进酚类物质含量高的葡萄酒的MLF。在葡萄酒样中加入2g/L的五倍子酸调整其总酚含量后添加甘露糖蛋白,加入乳酸菌a、b、c的酒样完成10%的发酵分别比CK提前了2,2,0d;完成MLF分别比CK提前了4,4,2d,说明在酚类物质含量较高的情况下添加甘露糖蛋白,也可以加快葡萄酒MLF。

本研究结果表明,人为地向葡萄酒中添加一定量的甘露糖蛋白,可以有效加快葡萄酒MLF的启动,并促进MLF的进程。根据本试验结果,对由于温度较低、pH值较低、酚类物质含量较高等不利因素而导致的葡萄酒MLF启动困难、发酵进程缓慢,可以考虑添加一定量的甘露糖蛋白,以促进MLF。用添加甘露糖蛋白促进MLF,在世界葡萄酒酿造工艺研究中还是一个比较新的课题,在国内的研究更少。要将甘露糖蛋白用于红葡萄酒的实际酿造中,还需要对添加量、添加时机、作用机理等作进一步深入研究。