原理
GST纯化系统是利用GST(glutathione-S-transferase ) 融合蛋白与固定的谷胱甘肽(GSH)
通过硫键共价亲和,通过GSH交换洗脱的原理来进行纯化。1ml树脂大约可结合5-8 mg融合蛋白,并可反复使用数次。
试剂
u IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)
2g IPTG 溶解入10ml 水,过滤除菌,分装,-20℃保存。
u Lysis buffer (50ml)
1) 2.5ml 1 M Tris,pH8.0
2) 0.1ml 0.5ml EDTA
3) 0.292g NaCl
4) 0.5ml Triton X-100
5) 0.25ml 1M DTT
u Elution buffer
1) 0.615g glutathione
2) 10 ml 1M Tris,pH8.0
3) 90ml distilled water
操作步骤
1) 挑一个克隆至2ml LB液中(Amp+)
2) 37℃振摇至OD600值约为0.6
3) 将2ml菌液加入100 ml LB中
4) 37℃振摇至OD600值约为0.6
5) 加入IPTG至终浓度为1mM
6) 继续摇3~4h
7) 离心(5000 rpm,5min,4℃)
8) 用10×柱体积的lysis buffer悬浮细菌
9) 超声破碎细胞
10) 离心(12,000rpm, 15min, 4℃),取上清
11) 用滤纸过滤
12) 加0.5 ml 50%谷胱甘肽琼脂糖beads于层析柱
13) 5×柱体积的lysis buffer洗层析柱
14) 样品过柱
15) 5×柱体积的lysis buffer洗层析柱
16) 3×柱体积的elution buffer洗脱蛋白
17) 收集蛋白:0.5ml/管
18) 取20ml样品SDS-PAGE鉴定