GST-融合蛋白的表达与纯化
2010-05-26 22:53:23   来源:不详   评论:0 点击:

原理         GST纯化系统是利用GST(glutathione-S-transferase ) 融合蛋白

原理        

GST纯化系统是利用GST(glutathione-S-transferase ) 融合蛋白与固定的谷胱甘肽(GSH)

通过硫键共价亲和,通过GSH交换洗脱的原理来进行纯化。1ml树脂大约可结合5-8 mg融合蛋白,并可反复使用数次。

试剂

u         IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)

          2g IPTG 溶解入10ml 水,过滤除菌,分装,-20℃保存。

u         Lysis buffer (50ml)

1)         2.5ml 1 M Tris,pH8.0

2)         0.1ml 0.5ml EDTA

3)         0.292g NaCl

4)         0.5ml Triton X-100

5)         0.25ml 1M DTT

u         Elution buffer

1)         0.615g glutathione

2)         10 ml 1M Tris,pH8.0

3)         90ml distilled water

 操作步骤   

1)         挑一个克隆至2ml LB液中(Amp+)

2)         37℃振摇至OD600值约为0.6

3)         将2ml菌液加入100 ml LB中

4)         37℃振摇至OD600值约为0.6 

5)         加入IPTG至终浓度为1mM

6)         继续摇3~4h

7)         离心(5000 rpm,5min,4℃)

8)         用10×柱体积的lysis buffer悬浮细菌

9)         超声破碎细胞 

10)      离心(12,000rpm, 15min, 4℃),取上清

11)      用滤纸过滤

12)      加0.5 ml 50%谷胱甘肽琼脂糖beads于层析柱

13)      5×柱体积的lysis buffer洗层析柱

14)      样品过柱

15)      5×柱体积的lysis buffer洗层析柱

16)      3×柱体积的elution buffer洗脱蛋白

17)      收集蛋白:0.5ml/管

18)      取20ml样品SDS-PAGE鉴定

可以在buffer里增加点蛋白酶抑制剂,防止蛋白的降解。
 

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