98) 手头有碱性磷酸酶的资料吗？能否告诉我它的详细结构 我想提纯 谢谢拉
最好还可以告诉我想关的提纯方法！它存在于细胞壁与膜之间,大概80K（四聚体）、32KD（二聚体）,它耐高温80度仍然保持活性（在有镁离子存在的情况下）,最适PH8.0
我现在已粗步提取下步想层析, 你看该选择什么材料填柱
蛋白没有什么详细的结构吧，至于纯化它既然是碱性的蛋白，那你可以直接用阳离子柱子做粗步纯化，此外既然它能耐受80度，那你这样处理，大多的杂蛋白就沉淀了被去除，再上离子交换就应该有不错的效果。
填料可以选择CM琼脂糖凝胶和SP琼脂糖凝胶。
99) 前几天我提取了一种菊科植物的蛋白，用的是tris—Hcl缓冲液，然后用100%丙酮沉淀蛋白，结果蛋白中含有色素杂质，属水溶性，颜色很深，请教高手，如何除去色素干扰，纯化蛋白？另外我也查了一些资料，说可能是花色素，于是我在100%丙酮沉淀后，加了一步0.1%甲醇，但是并没有显著的效果。
你说的花色素就是黄酮类的花青素吗，它有很强的亲水性，所以丙酮沉淀它也沉淀，你可以改用乙醇沉淀或者硫酸铵沉淀，这样色素就不会被沉淀了，你试试吧。
100) 用PB（pH6.8）或ABS(pH4.0)平衡时你们一般用多少柱床体积？10X够了吗？
一般也就3-5个床体积吧，离子交换需要平衡体积大点也，10X足够了
101) 有个关于胰岛素精纯化的问题想向你请教，我已取得95%纯度样品。但杂质大于1%，进一步纯化，用什么柱子，具体操作又怎样做呢，谢谢赐教。
我知道，我好象回复过，你用反相硅胶10um的柱子1.0X25cm或者2.2X25cm的柱子做制备，这样可以达到99%以上的纯度，别的方法很难做到你需要的纯度，此外胰岛素也可以用等电点沉淀的办法去掉一些杂质。
HPLC制备你可以参考相关的文献，其实也就是甲醇水或者乙腈水含三氟乙酸，先是低浓度吸附，然后提高浓度洗脱，详细的条件和你做反相纯化是一样的，只是HPLC的分离效果更好。
102) 请问怎样可以查到protein的PI值？，多谢了先！
已知的蛋白当然是查资料,未知的如果知道序列的话,可以用软件,你在论坛中搜索吧,有不少帖子的.
103) 谢了chromatography兄，也就是必需用小颗粒的硅胶填料了。
是的,需要用HPLC做制备,或者你优化的你工艺,看能不能提高纯度.
104) chromatography兄:
非常感谢回复，我手里也有一个GST融合表达的项目，经纯化后，用EK酶切时，出问题了。
目的蛋白是12KD左右，PI约PH9.5。用PH8.0，0.1M NACL条件酶切时，反应液发混，全部沉淀，切出的蛋白（约12KD）经尿素溶解，透析后，PH6.0不能挂上CM柱。用PH8.0，2mM CaCl2条件酶切时,也有发混，但目的蛋白有14KD左右，PH6.0可以挂上CM柱。不知是不是酶切条件有问题？
另外，chromatography兄，有化学破菌及EK酶切相关文献吗？给我发一份好吗，E-mail:zhangxstc@yahoo.com.cn
别客气,有沉淀也许是蛋白在那样的pH下溶解度不好,或者因为缓冲液的原因,挂不住会不会是没有切开,所以挂不柱.最好用电泳看看切的效果如何.
至于破碎我不很清楚,酶切你可以参考下面的东西:
http://www.ls.huji.ac.il/~purification/Purification_Protocols.html#Cleavage_Sites_Table_for_Fusion_Proteins
105) 我想用DEAE纤维素来做填料
我的粗提酶液蛋白含量大约为7mg/ml我该选择哪个型号的DEAE呢？
DEAE纤维素要是同一家公司的差别不大,最常用的也就是DEAE纤维素 DE-52,其实我觉得你还是选择DEAE琼脂糖凝胶,流速也快,好用,没有什么必要一定用纤维素,何况价格也不便宜.你做的是什么酶呢.
106) 我想请问一下您在装柱（尤其是分子筛柱子）是否是按照填料的说明正向装呢，还是反向装？
我两种方法都试过的，但是只有一次是正向装完后，检测效价为30，000。请问装柱过程中除了填料和水要脱气和填料要一次性的倒入外，还有没有其他要注意的。最好能给我一个Protocol。谢谢！
另外，还有一个问题，我有一个90kD的融合蛋白（连GST），用GST的亲和柱纯化后总是有50多kD和20左右的杂蛋白。我用Sephacryl－S100能去掉它们吗？或者您可以给我一个更好的建议
1，我不明白，当然是正向装了，反向怎么装呢，其实装柱子只要均匀就可以，我几乎没测定过柱效，也没有Protocol，因为一般装的都没有问题，只要注意你说的几个问题就可以。
2。至于纯化的杂带你用抗体做WB看是不是降解的物质呢，你可以优化你纯化的条件，在平衡液体中提高盐的浓度，这样可以降低非特异吸附，这样再做做看，此外你可以用5mM,10mM.20mM还原谷胱甘肽阶段洗脱看看有什么结果，我觉得你先优化完如果没有纯化好，再用凝胶过滤吧，你可以选择sephadex G75或者是Superdex G-75，这样你的目标蛋白在外水体积中出来，后面的杂质在内水体积中，这样效果会更好点，如果用前面的S100不会比后面的两个填料效果好的。
107) 我做的是碱性磷酸酶,大约32KD,我现在只做到硫酸氨盐析粗提,想进步纯化,你那有没有层析方面的资料,（比如材料的选择原则、洗脱液的选择、操作等方面）
这个蛋白硫酸铵沉淀后你可以直接用疏水,要不就透析,然后上阳离子交换的柱子,这样纯化不知道能到多少纯度,此外可以用亲和的办法,我看到的是把物质偶联到琼脂糖凝胶上做亲和,例如对氨基苯磷酸.洗脱用磷酸盐竞争洗脱就可以,这是比较好的方法.我给你发一份填料选择指南吧,也许会有的有点用处,此外把我见到亲和的文献发给你一篇
chromatography 大哥, 谢谢你拉, 资料我收到了, 我先看看还有问题在找你帮忙了,定向合成化学配基亲和层析纯化碱性磷酸酶, 新型染料配基对碱性磷酸酶的亲和纯化 是什么格式的我这解压缩后打不开了
文件是zip格式的,有winzip这个软件就可以打开了,应该很常见的.
