枯草芽孢杆菌B.SUBT12酶学性质研究
2007-12-18 23:07:16   来源：食品与发酵工业   评论：0 点击：

关键词:枯草芽孢杆菌；中性蛋白酶；酶学性质；

中国分类号: Q925.2     文献标码: A 

中性蛋白酶是一类适合于在中性条件下水解蛋白质肽键的酶类,最早被发现并广泛应用于工业化生产,可用于皮革脱毛、动物血液蛋白酶水解制备复合氨基酸营养液^[1]、大豆蛋白水解^[2]以及医学治疗^[3]等应用领域中。目前国内外有关中性蛋白酶的研究相当的多^[1-7]。酶作用条件不是酶的特征性参数,因环境的改变而改变,酶活力不仅受温度、pH的影响,而且还易受到金属离子、表面活性剂等环境因素的影响。因此,本试验着重考察了酶反应体系温度、pH值、金属离子以及表面活性剂对酶作用条件及稳定性的影响,希望通过此研究得到B.SUBT12的最佳反应条件和酶的稳定性,为其应用奠定良好的理论基础。

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种　由课题组分离得到，经初步鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )。

1.1.2 培养基

1.1.2.1 牛肉膏蛋白胨培养基^[8]  培养基配方略。

1.1.2.2发酵培养基^[9] 培养基配方略。

1.2 方法

1.2.1 菌种鉴定 通过观察菌落形态、培养特性及生理生化特性等对B.SUBT12进行鉴定。

1.2.2酶活力测定 按Folin-酚法^[10]

1.2.4 酶最适作用温度 将稀释粗酶液分别于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃不同温度下反应,测定其蛋白酶活力。以温度为横坐标,相对酶活力为纵坐标作图。

1.2.5 酶最适pH值的研究 分别配制pH(3.0～10.5)不同的1%的干酪素溶液,按Folin-酚法^[10]进行蛋白酶活力测定。以pH为横坐标,以相对酶活力为纵坐标作图。其中pH3.0-5.0由Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液配制,pH6.0-8.0由磷酸缓冲液配制,pH9.0由硼酸缓冲液配制,pH10.0由硼砂-NaOH缓冲液配制。

1.2.6 温度对酶稳定性的影响  取20ml稀释粗酶液于55℃恒温水浴10min、20min、30min、40min、50min、60min,然后测定其残存酶活力,以时间为横坐标,相对酶活力为纵坐标作图。

1.2.7 pH对酶热稳定性影响 用pH7.5的缓冲液定容1ml粗酶液至100ml,分别取20ml稀释酶液于40℃、50℃、60℃、70℃保温30min,测残余酶活。以温度为横坐标,相对酶活力为纵坐标作图。

1.2.8 金属离子对酶稳定性的影响 在稀释酶液中加入0.1mol/L的不同金属离子,保温30min,测定蛋白酶活力,以金属离子作横坐标,蛋白酶活力作纵坐标作图。

1.2.9 表面活性剂对酶稳定性的影响 在稀释粗酶液中加入不同体积的表面活性剂Tween80 (1-5ml),于40℃保温30min,然后测定其蛋白酶活力。以Tween-80添加量作横坐标,酶活力为纵坐标作图。

2 结果与分析

2.1 菌种鉴定

 细胞杆状,成链状排列,端口成圆形,芽孢椭圆或圆形,单芽孢,兼性好氧,能利用葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖和D-甘露糖产酸。葡萄糖产气,最适生长温度35-37℃, 5℃和50℃以上无法生长,菌落成乳白色,边缘整齐,表面有皱褶、隆起,菌落表面干燥,G⁺,菌落不透明,M.R试验、V.P试验、过氧化氢酶试验均为阳性,可利用丙二酸盐。初步鉴定为枯草芽孢杆菌.

2.2 酶最适作用温度

将粗酶液分别于不同温度下反应,测定其蛋白酶活力。结果如图1。从图1可以看出，酶在55℃酶活性最高，在45℃-60℃有较好的稳定性，酶最适作用温度为55℃。

2.3 酶最适作用pH值

将稀释粗酶液于不同pH值的缓冲液体系中反应,然后测定其蛋白酶活力,结果如图2。从图2可以看出,酶在pH7.5缓冲液体系中酶活力最高。因此酶最适pH为7.5。

                    图1 酶最适作用温度                                     图2 酶最适作用pH值

2.4 温度对酶稳定性的影响

将酶液于55℃保温10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min后,按Folin-酚^[9]法测定蛋白酶活力,结果如图3。从图3可以看出,酶的热稳定性较好。在55℃保温45min仍保持有近50%活力,当保温时间延长至60min或更长时,酶因热变性活力急剧下降甚至没有了活力。

2.5 pH对酶热稳定性的影响

将1ml酶液用pH7.5缓冲液稀释到100ml 并于55℃分别保温40min、50min、60min、70min,然后测定其蛋白酶活力,结果如图4。从图4可以看出,pH对酶有一定的保护作用。在此体系中反应,酶保温60min仍有近50%的活力,保温时间继续延长到70min时,酶因热变性酶活急剧降低。如果继续加长酶液的保温时间,酶会因为热变性完全失活。

2.6 金属离子对酶稳定性的影响

在稀释粗酶液中加入0.1mol/L不同的金属离子40℃保温30min,然后按Folin-酚法测定蛋白酶活力,结果如图5。

       从图5可以看出,Ca²⁺对酶有一定的激活作用和稳定作用,但激活作用不明显,这与许多相关报道相同^[11-13]。Fe³⁺ 对酶有强烈的抑制作用,作用机理有待于更一步深究。

2.7 表面活性剂对酶稳定性的影响

向稀释粗酶液中加入不同体积的Tween-80,40℃保温30min,测定其蛋白酶活力。试验结果表明,表面活性剂对酶有不同程度的激活作用(图略)。当添加量为5ml时,酶活达1286.36U/ml,比空白提高了近12.09%。可能作用机理为：表面活性剂亲水亲油基团有利于增强细胞膜的通透性,微生物蛋白水解酶均为胞外酶,膜通透性的增强有利于酶从膜内往外运输,也有可能是由于细胞膜通透性的改变打破细胞内酶合成的平衡机制,因此提高了发酵液中蛋白酶的产量。

3 结论与讨论

B.SUBT12经初步鉴定为枯草芽孢杆菌，酶学性质研究表明最适作用温度为55℃，最适作用pH值为7.5，酶的热稳定性较好，pH对酶有一定的保护作用，在pH7.5的反应体系中，酶在55℃保温60min时，酶有50%的活力，时间延长至70min时，酶仍有30%的活力，缓冲液对酶的“保护”作用可能是由于缓冲液有利于酶三级结构的稳定，因此，温度对其作用效力得到缓和。金属离子对酶有一定的激活作用，但激活作用不太明显，可能是由于“金属桥”的形成有利于酶与底物的结合。表面活性剂对产酶也有激活作用，添加5ml Tween80到反应体系中,酶活提高了12.09%。

  参考文献

[1] 卢寅泉,刘昭明 酶技术开发动物血制取复合氨基酸营养液的研究[J] 食品科学.1995, 16(7).-13-18

[2] 郑玉锖,李 珑 大豆分离蛋白酶解过程的研究与产物分析[J] 福州大学学报：自然科学版.1996,24(2).-109-113

[3] 朱建民,张庆宏 中性蛋白酶在骨新生中的作用[J] 中华骨科杂志.1996,16(8).-519-521

[4] 杨世平 米曲霉中性蛋白酶特性的研究[J] 湛江海洋大学学报. 2006,04:26~29

[5] Moyan Chen. Effects of temperature, pH and NaCl on protease activity in digestive tract of young turbot, Scophthalmus maximus[J]. Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 2006, 3:88~94

[6] Federico J. Wolman, Mariano Grasselli ,Osvaldo Cascone. Rapid neutral protease purification by dye-affinity membrane chromatography [J] Process Biochemistry, 2006,1: 356-361

[7] Chandran Sandhya, Alagarsamy Sumantha, George Szakacs.Comparative evaluation of neutral protease production by Aspergillus oryzae in submerged and solid-state fermentation[J] Process Biochemistry, 2005,8:2689-2694

8 赫 林 食品微生物实验技术[M] 北京 中国农业出版社 2001

9 肖怀秋 林亲录 李玉珍 赵谋明 产中性蛋白酶菌株B₄发酵条件的研究[J] 食品与机械 2004(5):23~25,28

10 姜锡瑞 段钢 著 新编酶制剂实用技术手册[M] 中国轻工出版社 2002

11 薛林贵 冯清平 紫外诱变原生质选育高产碱性蛋白酶菌株的研究[J] 兰州大学学报(自然科学版) 1997,32(2):72-78

12 孙 谧 修朝阳 王跃军 等 黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶性质鉴定[J] 海洋水产研究 2001,22(2):1-10

13郭杰炎 主编 微生物酶[M]  北京,科学出版社,1986