动物细胞大规模培养工艺进展与相关专利介绍
2007-10-24 23:16:00   来源：本站原创   评论：0 点击：

动物细胞规模化生产重组蛋白和抗体的工艺选择可考虑使用当前较成熟的工业化支持技术平台，以缩短产品工艺研发的时间，加快工业化进程。当前已获FDA批准的生物技术产品以及公开发表的生产工艺中，占有主流优势的是搅拌式生物反应器悬浮培养，工艺设计是流加或灌注培养。其大规模细胞培养生产所面临的挑战是获得最大生产力的同时注重维持产品的质量；去除所有培养环境中外源因子的污染；更为精确有效的工艺控制手段；规模化培养中氧气的限定与溶解CO2浓度累积的控制等。
 
1996年1月至2002年12月美国获得成功批准的不同的治疗剂和诊断剂产品共31种，其中用哺乳动物细胞培养生产的就有21种。动物细胞培养技术已经成为一个受到普遍信任的产业化生产技术，并逐步形成商业化操作水平。现将1996~2000批准的18种产品分为重组治疗药物、疫苗、组织培养产品和诊断试剂连同它们的生产形式列于下表：
 
表  BLA哺乳动物细胞培养系统来源产品 (1996~2000)

BLA产品名	厂商	批准日期	产品形式	细胞系	方法	培养液
重组蛋白
Tenecteplase/TNKase 急性心肌梗死	Genentech	6/2/00	重组糖蛋白	CHO	无报道	无报道
抗血友病因子	Genetics Institute	3/6/00	重组糖蛋白	CHO	连续灌注	无血清
Trastuzumab/Herceptin 转移性乳腺癌	Genentech	9/25/98	嵌合抗体	CHO	搅拌生物反应器,悬浮	无血清
Infliximab/Remicade Crohn’s disease	Centocor	8/24/98	嵌合抗体	NS0	搅拌,悬浮灌注培养	无血清
Palivizumab/Synagis 预防呼吸道病毒	MedImmune	6/19/98	嵌合抗体	NS0	搅拌,悬浮灌注培养	无血清
Basiliximab/Simulect预防急性器官排斥	Novartis Pharmaceuticals	5/12/98	嵌合抗体	鼠骨髓瘤	搅拌,悬浮灌注培养	无血清
Daclizumab/Zenapax 预防急性器官排斥	Hoffman-LaRoche	12/10/97	嵌合抗体	SP2/0	无报道	无报道
Rituximab/Rituxan 淋巴瘤	IDEC Pharmaceutical /Genentech	11/26/97	嵌合抗体	CHO	搅拌,悬浮培养	含庆大酶素
Coagulation factor Ⅸ 重组凝集因子	Genetics Institute	2/11/97	重组糖蛋白	CHO	搅拌,悬浮,反复批式培养	无血清
Interferon-1a/Avonex 治疗复杂性硬化	Biogen	5/17/96	重组糖蛋白	CHO	搅拌,悬浮培养	无报道
疫苗
轮状病毒	Wyeth Laboratories	8/31/98	肝过滤病毒疫苗	FRhL-2	未透露	含胎牛血清
狂犬病毒	Chiron Behring	10/20/97	灭活狂犬病毒	无报道	无报道	无报道
甲肝疫苗	Merck &Co	3/29/96	灭活病毒	人二倍体 纤维母C	连续流加培养	含血清
组织培养产品
Chondrocytes/Carticel 软骨缺陷修复	Genzyme Tissue Repair	8/22/97	自体同源细胞	软骨细胞	组织培养	含血清
诊断试剂产品
人T淋巴细胞病毒用于酶联ELISA	Abbott Laboratories	8/15/97	抗体	慢性感染人T、B淋巴细胞	无报道	无报道
Capromab pendetide 肿瘤诊断	Cytogen	10/28/96	鼠IgG1	杂交瘤	中空纤维反应器	无血清,含转铁蛋白
Nofetumomab/Verluma 肿瘤诊断	Dr Karl Thomae	8/20/96	鼠IgG2b Fab抗体	杂交瘤	无报道	无血清
Imciromab pentetate 心肌诊断	Centocor	7/3/96	鼠IgG2 Fab抗体	杂交瘤	无报道	血清,含庆大酶素

 
就搅拌式生物反应器悬浮培养动物细胞的工艺而言，目前流加或灌注培养生物工程细胞（如中国仓鼠卵巢细胞CHO、杂交瘤细胞hybridoma）的活细胞密度已经可以达到107水平。下面将2000年以来相关国内外研究进展报道如下：
 
在连续灌注培养工艺方面，美国Ohashi, Ryo 等人2001年报道采用2L一次性生物反应器灌注培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体，以Becton Dickenson Cell Mab+10%胎牛血清+1％聚醚F-68为培养基，最高活细胞密度超过1×107cells/ml；2001年瑞士Heine, Holger等人用带超声细胞分离器(UCS)的连续灌注搅拌罐生物反应器培养鼠杂交瘤细胞生产单克隆抗体，稳态培养时活细胞密度超过2×107cells/ml；2004年德国Thomas等人在1L搅拌罐生物反应器中培养rCHO细胞生产人MUC-1糖蛋白，采取葡萄糖浓度限制的高产率灌注工艺减少有害代谢物，代谢转向TCA循环增加，活细胞密度保持在(1～2)×107cells/ml。国内第四军医大学、华东理工大学、中国科学院上海细胞生物学研究所等单位从事了这方面的研究。其中第四军医大学冯强等人2002年报道采用5L CelliGen反应器连续灌注培养杂交瘤细胞，研究杂交瘤细胞在无血清培养基中的生长、代谢情况和氧消耗的关系，培养第9天细胞密度达到8×106cells/ml以上。
 
在流加悬浮培养工艺方面，美国麻省理工Xie Liangzhi等人2000年报道在2L生物反应器中流加培养杂交瘤细胞，通过营养控制降低氨和乳酸的比生成速率，补充培养基包括营养成分、胎牛血清和痕量金属，最大活细胞密度达到1.7×107cells/mL；2003年美国Gibco公司建立的流加培养rCHO表达rβGal系统，采用化学修饰的无蛋白CHO细胞培养基并增加TCA循环，生物反应器中活细胞密度最高可达107cell/ml。国内中国医学科学院、华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室、中国科学院化工冶金研究所生化工程国家重点实验室、兰州生物制品研究所致力于动物细胞流加悬浮培养工艺的研究与应用。其中2004年兰州生物制品研究所建立的血型单克隆抗体试剂规模化生产工艺，将血型杂交瘤细胞接种于15L转瓶中，采用流加式旋转悬浮培养第5天活细胞密度达到3.8×106cell/ml。
 
流加或灌注培养CHO、杂交瘤细胞工艺水平相关专利介绍：
 
JP5146290在特定细胞浓度和葡萄糖浓度下灌注培养哺乳动物细胞
申请日1991.03.11公开日1993.5.15
申请人：TEIJIN LTD
简介：灌注培养哺乳动物细胞人B细胞杂交瘤，稳定期保持培养基(ITES-eRDF，包含转铁蛋白、胰岛素、乙醇胺、亚硒酸钠)中葡萄糖浓度在3.5～30mmol/L，细胞密度超过8×106/ml。
 
US5672502动物细胞培养
申请日1995.02.28授权日1997.09.30
专利权人：CELLTECH THERAPEUTICS LTD(GB)
简介：在5升气升发酵罐中流加培养NBI杂交瘤细胞，培养基为DMEM+3％v/v胎牛血清，谷酰胺、糖、基本氨基酸等营养补充物的组分定量是基于谷酰胺分析的营养利用模型，最大活细胞密度达到2.5×106cell/ml
 
CN02125628一种动物细胞的优化流加悬浮培养方法
申请日2002.07.25公开日2004.01.28
申请人：谢良志
简介：动物细胞优化流加悬浮培养方法，通过研究细胞生长动力学来确定细胞生长所需营养物质的最低浓度，通过化学计量的方法确定合成一个细胞所需要的所有关键营养物质的比例，以此为基础设计加料物流中所有营养物质的合理配方，按营养物质的消耗速率加入加料物流，以对细胞生长的化学环境进行控制，然后根据本次实测的实验数据对化学计量模型中的可调参数进行优化，重复上述步骤进行迭代直到最优
US6048728提高细胞生长率、培养寿命和产物表达的细胞培养基
申请日1995.06.07授权日2000.04.11
专利权人：Chiron Corporation
简介：用无血清培养基和特定成分流加工艺，培养杂交瘤D-234细胞生产单克隆抗体，130小时达到最大活细胞密度达到1.8×106cell/ml，最终抗体活性为470mg/L
 
ZL01131736.1连续灌注式培养杂交瘤细胞制备抗体的工艺方法
申请日2001.09.29授权公告日2004.07.21
专利权人：陈志南
简介：对连续灌注式培养杂交瘤细胞制备抗体的工艺方法，接种细胞采用固定床填充巨载体，细胞代谢、生长速率、产物合成平衡调控是对葡萄糖、乳酸以及pH值等指标进行分析，在细胞由对数生长期进入衰退期之前，添加相应的氨基酸，并降低葡萄糖和血清浓度，细胞由以生长代谢为主转为以产物合成为主，实现多个稳态培养，杂交瘤细胞在低/无血清培养基连续培养20～40天，最大细胞密度可达(3～9)×107cells/ml，抗体产量200～800mg/L/d
 
CN02110583.9一种改进的肝癌鼠源单克隆抗体的制备方法
申请日2002.01.18公开日2002.09.04
申请人:中国科学院上海细胞生物学研究所
简介：在DXL无血清、无蛋白培养液中添加了各种生长因子,采用填充床式生物反应器高密度杂交瘤细胞连续培养，反应器中细胞密度达1.1×108cells/ml，每升培养液的单克隆抗体的得率达到1000～1500mg。
 
参考文献：
1.动物细胞大规模培养生产蛋白的工艺选择. 中国生物工程杂志. 2003,23(7), 1-6
2.杂交瘤细胞培养中摄氧速率（OUR）的在线检测及其与细胞生长及代谢的关系. 生物工程学报. 2003,19(5).-593-597
3.连续灌注培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体.生物工程学报. 2002,18(3).-360-364
4.Perfusion cell culture in disposable bioreactors.Animal Cell Technology: From Target to Market, Proceedings of the ESACT Meeting, 17th, Tyloesand, Sweden, June 10-14, 2001, 403-409.
5.Ultrasonic cell separation - production of monoclonal antibodies in continuous perfusion cultures.Animal Cell Technology: From Target to Market,Proceedings of the ESACT Meeting, 17th, Tyloesand, Sweden, June 10-14, 2001,386-388.
6.Bioprocess development for the production of a recombinant MUC1 fusion protein expressed by CHO-K1 cells in protein Free medium. Journal of Biotechnology 110 (2004)51-62
7.血型单克隆抗体试剂规模化生产工艺的建立. 微生物学免疫学进展.2004,32(2).-22-24
8.葡萄糖限制的流加培养中杂交瘤细胞生长、代谢和单抗生成. 华东理工大学学报：自然科学版.2003,29(5).-476-479
9.Fed-batch culture of hybridoma cells in serum-free medium using an optimized feeding strategy. J. of Chem. Tech. and Biotech.,79(2), 171-181，2004
10.生物反应器培养CHO细胞的生长与代谢研究. 云南大学学报：自然科学版.2002,24(5).-388-392
11.optimized nutrient additives for fed-batch cultures. Biopharm International,April,2003,p34-40
12.杂交瘤细胞的代谢流量分析. 生物工程学报.2000,16(6).-740-746
13.High cell density and high monoclonal antibody production through medium design and rational control in a bioreactor. Biotechnology and Bioengineering,Vol.51(6),p725-729
14.美国食品与药品监督管理局网页