生物表面活性剂发酵条件的优化、提取与分析
2007-08-05 12:40:39   来源：本站原创   评论：0 点击：

3．2发酵条件优化

选择了在表4中效果最明显的来自于化油后段的酵母菌作为发酵优化的试验菌株。采用酵母霉菌富集培养基作为基本发酵液。

3．2．1 碳源进行优化

分别用不同的碳源来代替正己烷来制备发酵液，大豆油和正烷烃取8ml，玉米浆和葡萄糖配成60g/l的溶液，取8ml。接种后放入摇床28℃下振荡培养70小时，转速为160r/min。测定去杂发酵液排油直径，结果见表5。

表5 不同碳源发酵液的排油直径

注：大豆油在离心过程中很难将油和发酵液分离干净，所以测定值可能有较大误差。

由此可见，由玉米浆作为碳源是比较合适的。

3．2．2 氮源的优化

分别用不同的氮源来制备发酵液，碳源用玉米浆，3种氮源取0.3%。接种后放入摇床28℃下振荡培养70小时，转速160r/min。测定排油直径，结果见表6。

表6 不同氮源发酵液的排油直径

由此可见，由尿素作为氮源是比较合适的。

3．2．3 初始pH值的优化

采用调节初始pH的方法来决定最佳的发酵初始pH值。摇床28℃下振荡培养70小时，转速为160r/min。测定排油直径，结果见表7。

表7 不同初始pH发酵液的排油直径

由此可见，在pH值为7.0左右时，比较适合于发酵培养。

3．2．4 溶氧量的对比

采用选出的最佳碳源，氮源以及初始pH。我们选用28℃摇床振荡培养70小时，转速为160r/min，120r/min以及无振摇的温箱培养作为对比。结果见表8。

表8 不同溶氧量发酵液的排油直径

由此可见，此种菌种耗氧量比较大。

3．2．5 发酵温度的对比

采用选出的最佳碳源，氮源及初始pH，但采用不同发酵温度来进行摇床发酵培养。选用28℃下和37℃下振荡培养70小时，转速为160r/min。结果见表9。

表9 发酵温度发酵液的排油直径

由此可见，体温显然不适合此种菌株的发酵。

3．2．6 发酵条件的优化结果

最优发酵条件为：硫酸铵0.6g，磷酸二氢钾0.3g，磷酸氢二钠0.2g，硫酸镁0.08g，硫酸亚铁0.001g，氯化钙0.01g，酵母膏0.05g，微量元素溶液0.5ml，玉米浆0.12g，尿素0.3%，蒸馏水100ml。初始pH值为7.0，发酵温度为28℃，振荡培养70小时，摇床转速为160r/min。

3．3 产物的提取

3．3．1 产物提取

用优化后的发酵条件进行发酵，得到的发酵液进行产物提取。实际进行5次萃取，每次的产量见表10。

表10 发酵液与产物关系

根据上述结果，100ml发酵液的产量大约在0.1g左右，产物为淡黄色或无色晶体。

3．3．2 产物测定

（1）在发酵液进行产物提取之前，测定的发酵液排油直径，见表11。

表11 发酵液的排油直径

（2）将得到的5份产物重新加水溶解至100ml，测定排油直径，结果如表12。

表12 产物的排油直径

（3）由以上的两组数据比较可知，产物的确为生物表面活性剂。但是比较而言，重新溶解的产物比发酵液的活性高出不了很多。

（4）经薄层层析鉴定，该产物为糖脂。

结论

通过筛选，从5处样品中筛选出3株能表面活性较好的生物表面活性剂的菌株，其中1株细菌，2株酵母菌。对于其中效果最好的酵母菌进行发酵条件优化，通过对于酵母培养液的各种成分的进行调整，最后将可以测得的最大排油直径的发酵条件作为最优发酵条件。用优化后的发酵条件进行发酵培养，用萃取的方法提纯产物，最后得到晶体产物。

（1）产生生物表面活性剂的菌种的获取是十分容易的，在一般的城市中都可以得到。一般的实验条件下都可以进行菌种的筛选，这十分有利于应用到工业生产中去。

（2）生物表面活性剂的发酵条件的优化是要基于菌株的种类而定，不同的菌种对应于不同的发酵条件。本设计中，由于实验条件和时间所限，无法对于所得到的菌种进行下一步鉴定，所以只能使用针对普遍菌类的培养基进行配方上的修正来达到优化发酵条件的目的。但是对培养基的优化仅仅是针对于试验室研究，对于工业生产，应以实际出发，模拟大型发酵罐的实际条件来进行处理。

（3）生物表面活性剂的提纯，采用了最流行的萃取的方法，也采用了萃取生物表面活性剂最常用的甲醇和氯仿的混合液进行萃取。尽管氯仿/甲醇有较好的萃取效果，然而，在工业上，大量的使用氯仿作为萃取剂是不经济的。而且，氯仿是高毒性的含氯有机物，对环境、对人体都有害。所以在工业上不建议使用这种提取方法。但是相比较一些文献上的产率报道而言，本次课题的实际产率不是很高。而且无法分析纯度，所以试验只能停留在表面层次的产率上。目前还只能在实验室里进行小剂量的生产，无法应用到工业的大规模生产中，其中萃取的方法就是一个瓶颈，还有待于进一步提高技术，增加产量。

                                                                 参考文献          

1  孙炳寅，徐志伟，微生物产生的生物表面活性剂，生物技术，1994，4(4)：1～6；

2  梅建风，王　普，生物表面活性剂，精细与专用化学品，2002(10)：11～12；

3  夏咏梅，方　云，生物表面活性剂的开发和应用，日用化学工业，1999，2(1)：27～31；

4  房秀敏，江  明，生物表面活性剂及其应用，现代化工，1996(6)：17～20；

5  庄　毅，马梦瑞，生物技术与生物表面活性剂，山东化工，1994(1)：20～26；

6  丁立孝，何国庆，孔　青等，微生物产生的生物表面活性剂及其应用研究，生物技术，2003，10(13)：52～54；

7  范立梅，生物表面活性剂，生物学通报，2000(35)：21～22；

8  Sarkar A K，Gours J.C.Sharma M M，et al. a critical evaluation of MEOR process[J].In Situ，1989，13：207～238；

9  张翠竹，，梁风来，张心平等，一种脂肽类生物表面活性剂的理化性质及其对原油的作用[J]，油田化学，2000，7(2)：172～174；

10  Rapp P，Bock H，Wager F et al. Use of tehalose lipids in enhanced oil recovery Biotechnol，1997，81：177～185；

11  Inoue，S，Kimwa Y，Kinta M et al. German Patent 2905252 to Kao Soap Co.. Japan，1979；

12  Inoue，S，Kimwa Y，Kinta M et al. German Patent 2905292 to Kao Soap Co.. Japan，1979；

13  White R T，Damm D，Miller J et al. Isolation and characterization of the human palmonary surfactant aporoteingene， Nature，1985，317：316～320；

14  Shephord R，Rockey J，Shutherland I W et al. Novel bioemulsifier from microorganisms for use in foods， J Biotechnol，1995，40：207～217；

15  Mulligan C N，Yong R N，Gibbs B F，Heavy metal removal from sediments by biosurfactants[J]，Journal of Hazardous Materials，2001，85(1)：111～125；

16  李祖义，杨勤萍，生物表面活性剂的合成，精细与专用化学品，2002(15)：6～8；

17  Kuyukina M S，Ivshina I B，et al. Recovery of Rhodococcus biosurfactants using methyl tertiary-butyl ether extraction[J]，Journal of Microbiological Methods，2001，46：149～156;

18  R.S. Makkar ，S.S. Cameotra，Appl Microbiol Biotechnol ，2002(58)：428～434；

19  Kuyukina M S，Ivshina I B，Philp J C，Journal of Microbiological Methods，2001，46：149～156；

20 潘冰峰，徐国梁，施邑屏等，生物表面活性剂产生菌的筛选，微生物学报，1999，39(3)：264～267；

21 李清心，康从宝，王  浩等，假单胞菌L-11产生生物表面活性剂发酵条件的优化，微生物学通报，2002，29(2)：21～24。