生化需氧量微生物传感器的研究进展[一]：引言
2009-08-31 18:45:19   来源：本站原创   评论：0 点击：

水是生命之源，是地球上唯一不可替代的自然资源，而目前水的污染日益严重，甚至威胁着人们的生存。衡量水的污染程度的水质指标卞要有pH值、电导率、溶解氧、浊度、水中油、生化需氧量(BOD)、总有机碳(TOC)、重金属离了和其他有害的离子等。其中BOD值表示水中有机物经微生物分解时所需的氧量，是环境监测中必须测定的重要指标之一。BOD值愈高，表示水中有机物越多。常规测定方法为5d法(BOD5 )，也有些国家为了避免周末化验，采用7d法(BOD7)作为衡量指标。由于这种分析方法所用时间较长，重复性差，受干扰因素多，不能及时反映排放水的污染程度，从而也无法进行现场监控。为了达到及时监测水质污染程度的日的，多年来人们一直在寻求快速测定BOD的方法，其中微生物传感器测试法显示出广阔的应用前景，这是一种将微生物性能与电化学转换器相结合的方法。利用微生物作为敏感材料是基于:(1)微生物细胞内含有对从外部摄入的物质进行代谢的酶体系，它具有从微生物菌体中的单一酶功能到功能范围很广泛的微生物生理功能;(2)微生物能够繁殖生长，或者能在营养液中再生，因而有可能长时间保持催化剂的活性，延长传感器的有效使用期限。
 
生物传感器是由生物识别元件和物理换能器所组成，它能将被测物的浓度与可测量的物理化学信号关联起来。被测物通过扩散进入生物敏感膜层，经分了识别，发生生化反应后，所产生的信息被相应的物理换能器转换成与被测物浓度相关的物理化学信号。生物识别元件(即生物敏感膜)是生物传感器的关键部分，也是传感器进行选择性检测的基础，它直接决定传感器的功能与质量。按被选材料不同，可将生物传感器分为酶传感器、免疫传感器、组织传感器、微生物传感器及细胞传感器等。按生物传感器与底物作用机理的不同，又可将传感器分为生物催化型传感器和生物亲和型传感器。生物催化型传感器包括酶传感器、组织传感器和微生物传感器等;而生物亲和型传感器包括免疫传感器和DNA传感器。根据生物反应产生信息的物理或化学性质，换能器通常采用电化学、光谱、热汪电及表面声波等技术与之相匹配，而由此衍生出电化学生物传感器、半导体生物传感器、光生物传感器、热生物传感器和压电品体生物传感器等。电化学换能器被广泛应用于传感器的制备，因为它具有许多的优势，如它能在浑浊的溶液中操作，具有较高的灵敏度并目容易微型化。另外，所用的仪器简单、便宜，而电极体系的连续操作可以在线测定物质的变化。

对于应用于复杂的反应过程的生物传感器来说，使用微生物或细胞能方便一些。另外在合适的培养基中微生物能再生，以补充失活的微生物。微生物传感器的选择性一般不高，但其这一特点可用来制备生化需氧量(BOD)生物传感器。微生物是在活的状态下作为敏感材料的，因此，固定方法较为温和，一般有吸附、包埋等物理方法，交联、共价等化学方法。构造微生物传感器必须注意:(1)以氧电极为基底的传感器的情况下，固定微生物的膜必须保持透气性;(2)传感器的敏感物质是基于活细胞，必须选择温和的固定化方法，使所固定的生物体不失活，保持生物识别元件的活性和稳定性是非常关键的步骤。目前已研究了多种微生物传感器，广泛地用于诸如环境监测、发酵和食品工业，表1总结了微生物传感器的分类及特征。

根据微生物和待测物结合后产生信号性能不同可将微生物传感器分为:电化学型传感器和生物发光型传感器等。根据微生物生理学特点，电化学型又可分为呼吸活性测定型和电极活性测定型。BOD传感器属于呼吸活性测定型，它大多是由微生物固定化膜和氧电极所构成。如将活的微生物吸附于多孔性醋酸纤维素膜上，再将此膜装在氧电极的透气膜上(也有将微生物固定在珠型载体上，再装入柱管中与氧电极成分离型结构，当这种微生物传感器浸入含有有机化合物的试样溶液中时，有机化合物则向微生物膜内扩散，被微生物同化。微生物同化有机化合物后，其呼吸活性增强，这一变化可用和微生物膜相接的氧电极转化为扩散电流值，从而可间接地计算BOD值。目前应用最广泛、最普通的商品化的溶解氧电极是由Clark设计的膜电极，温度、透气膜和电解质层的厚度不同程度地影响其灵敏度。温度的改变对灵敏度有较大地影响，因为氧的可溶性和扩散常数都与温度有指数关系，所以测定时一般需要恒温。氧电极电解质层的厚度要尽量小，以使电极电流对电解质层厚度不敏感。透气膜的选择十分重要，因传感器的传质是受扩散速度限制的，故膜一定要薄，以确保良好的响应线性和低的背景电流。Clark电极可分为极谱型和电流型两种。极谱型电极由铂阴极和银阳极组成，两极都浸于饱和KCl溶液中，阴阳两极间加合适的极化电压(－650 mV)后，氧在阴极被选择性地还原:

氧化还原反应所产生的电流与溶液中溶解氧的浓度成正比。电流型电极由铅阳极和银或铂阴极组成它是一个原电池电极.不需要外加电压，其反应为:

这种类型的电极是结构简单、价格低廉，但与极谱型电极相比，其响应时间长，稳定性差。

1976年Vemimmen。等首先提出了用氧电极接种活性污泥测定BOD的方法;1977年Karub。等将兹抱酵母菌用聚内酞胺或骨胶原固定在多孔纤维素膜上，配以伏安式一电极体系的氧电极构成了第一个快速测定BOD的生物传感器，该传感器可在15 min左右测定污水的BOD值，结果与BOD5一致但是由于固定化骨胶原膜被菌酶破坏，仅10天传感器便失活;1979年H ikum。等改用多孔醋酸纤维素膜固定酵母菌制成的BOD传感器，使用寿命延长至17 d;后来Strand等研制出用活性污泥富集菌BOD传感器，用于城市污水测定，成功地工作了20多天;Suzuki和Karube在1982年申请了一种以铂和铅在氢氧化钾溶液中构成的用于BOD测定的原电池式生物传感器的专利。此后，每年都有大量的论文和专利产生，表2列出了部分BOD生物传感器的特征。

自1983年日本将BOD传感器开发成商品，并与BOD测定仪一起出售，型号为BODA-1100，其应用的废水类型是生活污水城市混合废水和废水处理厂废水，从而使BOD生物传感器走上了标准化和商业化的轨道。如今已有不少的商品化仪器问世，主要有日本的Nisshin Denki ( Ekectric) Co. Ltd.，德国的PGW GmhH, Dresden; Aucoteam GmhH,  Berlin及Dr.  Bruno Lane GmhH, Berlin。表3是国外几家公司的BOD生物传感器的主要参数比较。国内种有上海雷磁仪器厂生产过生物化学需氧量分析仪，沈阳分析仪器厂生产过SXI-V型快速BOD测定仪，以及天津赛普环保科技发展有限公司、青岛天林环保公司等。但至今为止，只有日本用BOD生物传感器法代替了传统的BOD5法，其核心问题即生物膜的制备和菌种的选择与培养均未达到完善的阶段，所以真正实现用BOD生物传感器法代替传统的BOD5法还需诸多探索。

从对BOD微生物传感器开始研究至今，用于构造生物膜的微生物己有多种，如皮状妊抱酵母、梭状芽抱杆菌、枯草芽抱杆菌、汉逊氏酵母菌、克雷白杆菌、假妊酵母菌、活性污泥、大肠埃希氏杆菌、丁酸梭菌、恶臭假单抱菌及嗜热菌等。表2只是列出其中一部分，其选择的原则是只要微生物在其代谢过程中允许通过电了转移系统传递电了，无论是原核生物还是真核生物都可用于构造微生物传感器。原核生物如杆状菌类的大肠杆菌、不动杆菌属、葡糖杆菌属、假单胞菌属和放线菌类，真核生物如毛抱了菌属的酵母菌等。考虑到灵敏度的问题，利用原核生物会更具优势，因为真核生物呼吸链的电了转移系统传递电了要经过线粒体而使传递电了到工作电极困难。但不同的菌对不同的有机物的降解能力不同，如绿浓假单胞菌对聚亚乙基二醇，洋葱假单胞菌对邻苯二甲酸醋，不动杆菌属、恶臭假单胞菌对联苯氯，恶臭假单胞菌对苯酚，梭菌属对有机汞化合物，甲基单胞菌属、汉逊酵母菌属对甲醇，汉逊酵母菌属、念珠菌属、葡糖杆菌属对乙醇，绿浓假单胞菌对含福化合物，恶臭假单胞菌、凸形假单胞菌对甲苯，卵状假单胞菌对间二甲苯，去磺弧菌属、氧化硫杆菌排硫杆菌对有机硫，产碱假单胞菌对硫菊，梭菌属对甲酸，甲基球菌属对甲烷，节细菌属、分枝杆菌属对乙烷，乳杆菌属对烟酸，短杆菌属对天冬氨酸，葡糖杆菌属对葡萄糖，假单胞菌属对丙三醇，恶臭假单胞菌对谷氨酸，类鼻疽假单胞菌对麦芽糖，枯草芽抱杆菌对乙酸，麝香石竹假单胞菌对蔗糖，恶臭假单胞菌对淀粉等有较强的降解能力。因此，在具体选择时可根据污水的具体情况而定。

由于能够实时、在线监测水体的污染情况，BOD微生物传感器己应用于城市污水及污水处理厂废水的监测，尤其是日本己将此方法做为工业标准。但由于所固定的微生物对不同的有机物降解能力不同的限制，与传统的BOD;相比，微生物传感器的应用存在着一定的局限性。这是因为这两种方法并不能等同:在BOD5法中，所选用的微生物是一个菌群，反映出的是该菌群5天的各种代谢活动的综合结果，其中包括所利用降解酶、水解酶的适应过程;而微生物传感器则是所固定的一种(或两种)微生物在较短时间内(< 20 min)所表现出来的活性变化，因而只是对污水中易降解的有机物响应，对于污水中所含有的大分了物质如蛋白质、淀粉等的响应则不充分。故这两种方法不会得到完全一致的结果，关键是使其具有可比性。对此也做了不少的尝试:(I)选择降解有机物种类更广泛的微生物； (2)对不同的污水采用不同的微生物，如对流出物和河水等具有较低的BOD值、含高浓度欲的废水及含重金属的废水分别固定不同的微生物来构造传感器,加入媒介体以促进电了转移等;(3)由于每种菌的代谢都有一定的局限性，选择两种以上的混合菌固定到同一生物膜上构造传感器，以扩大对有机物的降解范围，如将Citrobaclersp，和 Enterobacter sp. , Bacillus subtilis和Bacillus licheniforms 7B1, Rhoclococcuserythropolis和Issatchenkia orientalis固定在同一生物膜上以扩大其能降解的有机物的种类，然而不同菌种之间又可能存在相互干扰作用而改变传感器的特征，甚至影响传感器的使用寿命。为解决这一问题，Konig等利用生物芯片技术构造了多种微生物固定在一起的传感器，从而避免了可能存在的相互干扰;(4)对含有机大分了物质的污水进行预处理:由于有机大分了物质如蛋白质、淀粉、脂类等在短短几分钟至几十分钟内是不可能完全降解，而将其预处理可使两种方法的结果具有可比性。如Rieclel等采用丝抱酵母与aˉ淀粉酶、中性蛋白酶和半纤维素酶联合固定的方式，用于快速测定复杂介质中总的BOD; Reiss等利用壳多糖和离了交换树脂( lewatit)固定aˉ淀粉酶和葡糖有酶，并将其置入商品化的微生物传感器，用于测量含大分了淀粉的污水;Kasel等将污水在 100℃时酸解1h，得到了与传统BOD5法比较一致的结果。