一株羽毛角蛋白降解菌的产酶条件研究
2010-07-10 13:35:50   来源：本站原创   评论：0 点击：

    角蛋白（Keratin）是禽类加工中产生的废弃物——羽毛的主要组分,其粗蛋白含量高达80%以上,各种氨基酸总量达70%以上,并且富含多种动物所需要的必需氨基酸,是一种非常有应用前景的饲料蛋白源。但是由于角蛋白分子间通过胱氨酸的二硫键、氢键、盐键和其它交联键作用形成高度交联的三维结构，非常稳定，动物来源的蛋白酶（胰蛋白酶、胃蛋白酶等）也很难有效地降解它，因此很难被动物消化分解和吸收利用，致使其未被大量地开发利用。高温蒸煮或化学处理虽可以改进角蛋白的消化率，但明显存在耗能大、产品的营养质量易被破坏、三废不易处理、环境污染严重等问题。近年来随着现代农业技术的发展，禽畜养殖规模不断扩大,一方面使动物性饲料蛋白（氨基酸）资源严重短缺；另一方面产生大量的角蛋白废弃物，对人类的生态环境造成了严重的污染。因此，如何将羽毛等角蛋白废物降解转化为动物可吸收利用的蛋白资源已成为当前饲料工业的研究热点。角蛋白酶（Keratinase）是一类自然界中某些微生物分泌的、具有专一的降解天然角蛋白功能的酶类，可有效地将羽毛等角蛋白废弃物转化为可消化蛋白。角蛋白酶具有特异性地分解角蛋白的特性，使其在饲料工业、食品工业、皮革加工、洗涤剂行业、医药工业及环境治理等方面具有广阔的应用前景。
试验筛选一株产角蛋白酶酶活高且具有较好酶学特性的优良菌株，对该菌株进行产酶条件优化，使发酵水平得以提高，在一定程度上降低生产成本，为该酶在实际生产中进一步应用奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌种
从养殖场水沟淤泥中筛选得到产角蛋白酶的地衣芽孢菌株K-19。
1.1.2 主要仪器
分光光度计(UV755B型)、迴转式恒温调速摇瓶柜(VPL-I型)、离心机（EBA13）、精密pH仪、水浴锅、电炉、电子天平、超净工作台。
1.1.3 羽毛粉（鸡毛粉）
由云南陆良酶制剂厂提供。
1.1.4 培养基
LB固体培养基：氯化钠1%、蛋白胨1%、酵母膏0.5%、琼脂 2%,自然pH值。
种子培养基：氯化钠1%、蛋白胨1%、酵母膏0.5%,自然pH值。
基础液体发酵培养基:NH4Cl 0.05%、NaCl 0.05%、K2HPO4 0.03%、KH2PO4 0.04%、 MgCl2·6H2O 0.01%、羽毛粉1%、酵母膏0.01％, pH值7.5。
1.2 方法
1.2.1 菌株的发酵
平板划线分离法接种少量菌种于LB固体培养基中,在37 ℃恒温培养箱中培养24 h。从上述培养基中挑取单菌落接种到装有20 ml种子培养基的100 ml三角瓶中,37 ℃、180 r/min摇瓶培养过夜，然后将种子培养液按2%的接种量转接到装有50 ml基础发酵培养基的250 ml三角瓶中,37 ℃、200 r/min摇瓶发酵培养72 h。
1.2.2 酶液制备
发酵液以10 000 r/min 离心10 min,取上清液，即为粗酶液。
1.2.3 角蛋白酶酶活测定
底物偶氮角蛋白(Azokeratin)的制备参考Tomarelli RM(1949)中所述方法进行。酶活测定步骤：20 mg 偶氮角蛋白(Azokeratin)均匀悬浮于3.2 ml 50 mM KH2PO4-NaOH缓冲液中(pH值8.0),震荡混匀,在50 ℃水浴中预先保温2 min;加入稀释适当倍数的酶液 0.8 ml,50 ℃水浴中精确保温15 min后加入10%三氯乙酸 0.8 ml,使酶反应终止;最后将反应液离心(10 000 r/min离心6 min),并在450 nm下测吸光值。对照组反应时先加10%三氯乙酸 0.8 ml使酶反应终止，再加酶液0.8 ml。
酶活定义：每1 ml酶液反应15 min后OD值增加0.01为一个酶活单位。重复3次取平均值。
2 结果与分析
2.1 不同诱导物对菌株K-19发酵产酶的影响
2.1.1 最佳诱导物试验
多数角蛋白酶是诱导酶，需要角蛋白底物作为外源诱导物。在不含羽毛粉的基础发酵培养基中添加1%的不同诱导物（鸡毛、鸭毛、指甲和人发，不加任何诱导物的培养基作为对照），保持其它成分不变，按照1.2.1节叙述的发酵方法摇瓶发酵，测定发酵液酶活，结果见表1。结果表明：鸡毛、鸭毛和羽毛粉对菌株发酵产角蛋白酶都具有诱导作用，尤其羽毛粉诱导酶的合成最显著，可能是由于羽毛粉经过一些前期处理，加上颗粒小，更容易被菌株降解和利用；而人发和指甲基本上无诱导作用。

2.1.2 羽毛粉含量的单因子分析
羽毛粉对菌株K-19发酵产角蛋白酶具有显著的诱导作用,菌株能以羽毛粉作为惟一的碳源、氮源、硫源和能源供生长需要。在基础发酵培养基中添加不同含量的羽毛粉,按照1.2.1节叙述的发酵方法摇瓶发酵,测定发酵液酶活,结果见图1。从图1可知,羽毛粉含量为1.5%时,菌株产角蛋白酶酶活最高,为136.5 U/ml;羽毛粉含量超过1.5%时产酶能力有所降低,这可能是因为随羽毛粉含量增大,发酵液粘稠度也增大，进而影响发酵体系的通风状况（氧的供应）所致。

2.2 辅助碳源对菌株K-19发酵产酶的影响
碳源在酶制剂生产中的作用比较复杂，一方面，它是构成菌体、合成酶的碳架以及能量的主要来源；另一方面，它往往对产酶还具有阻遏或诱导作用。因此，碳源是影响微生物产酶的主要因素之一。
2.2.1 最佳碳源试验
选择葡萄糖、蔗糖、麸皮、米糠、糊精、可溶性淀粉和玉米粉作为辅助碳源，在基础发酵培养基中分别添加1%的上述几种碳源，按照1.2.1节叙述的发酵方法发酵，测定发酵液酶活，结果见表2。

从表2中可以看出，葡萄糖、蔗糖、麸皮和米糠对菌株产酶不利，而糊精、可溶性淀粉和玉米粉能够不同程度地促进菌株产酶，尤其以玉米粉效果最好。这可能是玉米粉除碳水化合物外，还富含蛋白质。在提供了碳源的同时，还提供了氮源，进而提高了菌株发酵产酶的能力，而且从工业生产降低成本的角度看，玉米粉也是比较理想的碳源。
2.2.2 最佳碳源的单因子分析
选择产酶酶活高且价格低廉的玉米粉作为辅助碳源，在基础发酵培养基中分别添加0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的玉米粉，通过测定发酵上清液的酶活来考察不同的玉米粉添加量对产酶的影响，结果见图2。从图2可以看出，当玉米粉添加量为1%时菌株产角蛋白酶酶活最高，达157.9 U/ml，玉米粉添加量低于或高于1%时酶活有所下降。

2.3 辅助氮源对菌株K-19发酵产酶的影响
氮源是组成微生物细胞蛋白质、酶和核酸的主要元素之一，是影响酶产量的另一重要因素。
2.3.1 最佳氮源试验
在基础发酵培养基中分别添加1%的不同氮源，根据发酵液角蛋白酶酶活来考察不同的氮源对产酶的影响，结果见表3。从表3可知，有机氮源较无机氮源更有利于菌株产酶，黄豆粉的促产酶能力最强，其次是酵母膏。综合工业生产降低成本角度考虑，选取价格便宜且产酶效果好的黄豆粉作为氮源。

2.3.2 最佳氮源的单因子分析
在基础发酵培养基中分别添加0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的黄豆粉，测定发酵上清液的酶活，考察不同的黄豆粉添加量对产酶的影响，结果见图3。从图3可知，黄豆粉的浓度过高或过低都不利于菌株产酶，黄豆粉浓度为1%时酶活达到最大值，为203.8 U/ml。

2.4 添加其它金属离子及表面活性剂对菌株K-19发酵产酶的影响
在基础发酵培养基中分别添加其它金属离子，测定发酵上清液的酶活，考察其它金属离子对产酶的影响，结果见表4。从表4中可以看出，添加Ca2+菌株产酶稍有提高，但不显著；其它离子（Cu2+、Co2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+、Mn2+）对菌株产酶都有不同的抑制作用，尤其Cu2+和Co2+几乎可以完全抑制菌株产酶。

有研究表明，表面活性剂可以改善细胞膜的通透性，促进胞外酶的分泌。在基础发酵培养基中分别添加不同的表面活性剂（TritonX-100、吐温20、吐温80、SDS），考察它们对产酶的影响，结果（见表5）表明：吐温80对菌株产酶具有促进作用； 吐温20对菌株产酶影响不大；TritonX-100和SDS对菌株产酶具有强烈的抑制作用。

2.5 起始pH值对菌株K-19发酵产酶的影响
pH值是影响菌株生长的重要因素之一，每种微生物都有其最适宜生长的pH值。将菌株置于不同起始pH值的发酵培养基中摇瓶发酵，测定发酵液酶活，结果见图4。从图4中可以看到，当pH值在7.5～8之间，菌株产酶活力最高,与该菌株的最适生长pH值范围一致；pH值小于7或大于8.5时，酶活明显降低。

2.6 温度对菌株K-19发酵产酶的影响
将已接种菌种的基础发酵培养基置于不同温度下,摇瓶发酵产酶，结果见表6。从表6中可以看出，菌株K-19发酵产酶的最适温度为37 ℃,与该菌株的最适生长温度相符。

2.7 接种量对菌株K-19发酵产酶的影响
接种量的大小是决定菌株在发酵培养基中生长速度快慢的一个重要因素。以培养24 h的不同量的种子液接入发酵培养基（装液50 ml）中,摇瓶发酵产酶，结果见图5。当接种量为4%时，菌株发酵产酶最高，可达约176 U/ml。接种量过小时，由于菌体数量过低、生长缓慢，发酵周期延长，从而减少了蛋白的分泌总量,活性降低；而接种量过大时,由于发酵初期菌体生长迅速,培养基中菌体相对密度太大,营养物质多被用于菌体细胞合成,反而使角蛋白酶的合成受阻遏。

2.8 装液量对菌株K-19发酵产酶的影响
发酵产酶过程中，无论基质的氧化、菌体的生长或是酶的产生，均需要大量的氧。为考察通气量对菌株产酶的影响，在300 ml三角瓶中分别装入不同体积（30、40、50、75、100 ml）的基础发酵培养基，按比例接入相同接种量的种子液，摇瓶发酵产酶，结果见表7。从表7中可以看出,装液量越少，通风量越大，越利于菌株发酵产酶，但考虑到由于发酵时间相对较长，装液量少于30 ml时，培养基容易被蒸干的因素，所以选用30 ml作为最佳装液量。

2.9 正交试验优化产酶条件
上述单因子试验结果表明，碳源（玉米粉）、氮源（黄豆粉）、pH值、接种量这4种因素对菌株产酶量影响相对较大。据此设计了L934的正交试验，以确定菌株发酵产酶的最佳碳、氮源配比及最佳条件。方差分析结果表明：培养基中不同水平的玉米粉、黄豆粉对菌株所产酶活的影响差异显著（P<0.05）,而pH值和接种量在给定的范围内对菌株产酶的影响不大。
综合正交试验以及上述的单因子分析结果,该菌株产角蛋白酶的最佳发酵产酶培养基为:羽毛粉1.5%、玉米粉1%、黄豆粉1%、NH4Cl 0.05%、NaCl 0.05%、K2HPO4 0.03%、KH2PO4 0.04%、MgCl2·6H2O 0.01%、酵母膏0.01%，pH值7.5～8。发酵条件为：在250 ml三角瓶里装培养液30 ml，37 ℃，接种量 4%，200 r/min 摇瓶发酵培养72 h。在此培养条件下该菌株产角蛋白酶的最高酶活可达246.8 U/ml，比初始酶活(128 U/ml)提高了93%。经验证该菌株产酶稳定。
3 小结
地衣芽孢菌株K-19是一株优良的角蛋白酶高产菌株，具有较好的酶学性质。本试验对该菌株的发酵产酶条件进行了优化，进一步提高了该角蛋白酶产生菌的发酵水平，使得酶活由优化前的128 U/ml提高到246.8 U/ml。此外，得到的最佳碳源、氮源不仅能大幅度地提高其酶活，而且来源广泛、价格低廉，为该角蛋白酶应用于实际发酵生产奠定了基础。在今后的研究中，还需进行角蛋白酶的分离、提纯和固定化等方面的研究，并且通过基因调控等手段来进一步提高角蛋白酶的表达量并拓宽其应用范围。
（参考文献10篇，刊略，需者可函索）
（编辑：高 雁，snowyan78@tom.com）
钟巧芳，云南师范大学生命科学学院，650222，昆明市龙泉路355号云南师范大学新区生物园地705#信箱。
许波、黄遵锡(通讯作者)，单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：2007-04-09
★ 中科院“西部之光”人才培养计划项目