利用过滤培养技术生产大肠杆菌多核苷酸磷酸化酶的研究
2006-09-17 17:10:28   来源：不详   评论：0 点击：

 

 

利用中空纤维膜材料，在5升标准搅拌型自动控制发酵罐中进行大肠杆菌AS.1.183的过滤培养，大肠杆菌细胞的最高浓度可达250g/L（湿重，含水70%），细胞内多核苷酸磷化酶的活性可以稳定在80ug/g菌左右，发酵罐的体积生产效率比分批发酵提高近10倍。

 

多核苷酸磷酸化酶(Polynucleotide phophorylase.E.C.2.7.7.8)以下简称PNP ase)自从1955年被Ochoa^[1]等人发现以来，它在核酸的研究中起了重要作用。由于基因工程学和抗菌素毒药物学的发展，人们对PNPase的应用产生了巨大的兴趣，需求量不断增加。PNPase广泛存在于细菌，酵母菌，真核细胞以及高等动植物细胞中，目前多采用大肠杆菌进行发酵^[1.2]，由于大肠杆菌在发酵过程中产生的代谢产物抑制其生长，在分批培养时细胞浓度很低，只有8-15g(湿重)/L，细胞中PNPase活性一般在20u/g(湿菌体)左右^[3]，需要较大的发酵设备进行生产，故分离时间长，PNPase的活性回收率低。采用膜分离与补料发酵耦联技术（过滤培养）可克服分批发酵过程中代谢产物抑制生长、发酵后期营养缺乏、以及连续培养过程中稀释速率不能过高等缺点^{[5。9。10。11。12]}。对生产PNPas而言，可以达到在对数期未期收获大量菌体的目的。

 

 

 

1. 菌种：大肠杆菌(Egcherich Coli)  AS.1.183由中国科学院微生物研究所提供。

2. 过滤培养系统：由以下部分组成见图一。

①     自控发酵罐：日本L.E.MARUBISHI CO.LTD生产的5升磁力拌发酵罐。

②     膜材料：天津纺织工学院生产的中空纤维，其性能参数见表一。

 

 

 

表一、HF-300过滤材料参数

 

             膜型号      HF-300        纤维外径       1.2mm

             膜材料      聚砜          有效面积       0.7m²

             纤维总数    400-500根    截留分子量    50000Ddltons

             膜长度      50cm          操作压力      <=120Kpa

             外套直径    5.6cm         pH范围        1-13

             纤维内径    1.0cm         再生剂         次氯酸钠

 

③    液体输送泵，美国Cole Parmer公司生产的蠕动泵用做循环泵，日本L.E.MARBISHI公司的两台蠕动泵控制加料和排料，发酵罐中的液位用硅胶管连接。

3．菌体收集：用日本TOMY SEIKO公司的CM-60RN离心机，3000rpm,30min ,可得湿菌泥，含水量为7.0%。

4．摇床：使用美国NBS公司旋转摇床。

5．培养基：葡萄糖20g，酵母酶解粉10g, Na2HPO4 5g, K2HPO4 8g,蒸馏水1000ml，经121℃灭菌15分钟，为分批培养和过滤培养的培养基。

6．分批发酵：将大肠杆菌AS1.183接种于装有100ml培养基的500ml三角瓶中，于37℃,转带为200pm下，摇瓶培养16小时，接10%的接种量  种，在装3升纯状基的  升发酵罐中27℃,搅拌400  PH7。0溶解氧饱和度5%以下，发酵培养。

7．过滤发酵：种子培养方法与分批发酵相同，接种后按分批发酵方式发酵1-2小时，再开动过滤循环系统，循环速度控制在2升/分，稀释速度为0.25-1.5h^-1,其它条件用于批发酵。

8. 菌体集：3000rpm,离心30min，得到菌泥于-20℃冰箱储存。

9．测定方法：

①    菌体量测定：湿菌体(含水量70%)制备标准曲线。测定时了取发酵液1ml，稀释一定倍数，在570nm测定折光率，计算菌体重量。

② 葡萄糖测定：取发酵液，离心分离的上清液按照3，5二硝基水杨酸法测定^[4]

③ 大肠杆菌粗PNPase活力测定：取20g湿菌体(含水量70%)，加入80目玻璃粉，在研体中研磨20-30分钟，然后悬浮于500ml，PH8.2-8.5的0.02M Tris-0.001M EDTA缓冲液中，搅拌30分钟后，在2-4℃,3000rpm离心30分钟，上清液为粗酶液^[2]然后按PNPase紫外吸收法测定酶活力^[3]。以30分钟内催经形成相当于1.0光密度(O.D)的多核苷酸的酶量定义为一个活力单位。

④ 含氨量测定：取发酵液离心分离上清液，以微量凯士定氨法测定^[4]

试 验 结 果

一、大肠杆菌分批发酵：
    为了以后同过滤发酵方法的比较，了解PNPase活性同大肠杆菌生长的关系，首先对大肠杆菌分批发酵观察，结果见图（二、三）略。

    结果说明在过滤发酵中大肠杆菌的生长速度比分批发酵加快，对数生长期延长，细胞中PNPase活性增高，菌体得量提高，不论在化批发酵还是在过滤发酵，比生长速率同PNPase活性都几乎同步。

三、过滤发酵和分批发酵过程碳，氮源变化：
    在过滤发酵，稀释速率为D=1.0时，分批发酵条件同试验一，结果如下略：
    结果表明在分批发酵的对数期未期碳源和氨源的量还比较充分，但菌体已不再增加，说明代谢产物抑制生长。在过滤发酵时碳源和氮源下降很快，当葡萄糖浓度维持在2g/L以下，对过滤发酵不构成限制因素。

四、不同流加速率影响：
    在过滤发酵时培养基的不同流加速率(D)对菌体得率的影响见图十。在过滤发酵8小时时取样测定不同稀释速率下的PNPase活性，结果见表二和图十略
    试验结果说明流加越快，大肠杆菌的得率越高，但由于受膜能力的限制，不能无限增大。而较低的D值虽然培养基得到充分利用，但会成为生长限制因素，不利于单位重量菌体PNPase活性的提高。

五、过滤发醇和分批发酵生产PNPase的比较：
    以稀释速率D=1.0进行过滤发酵，其它条件两种发酵相同，结果见表三。

表三