海藻酸裂解酶的发酵条件优化
2006-09-17 17:12:31   来源：不详   评论：0 点击：

    海藻酸是一种由a．L一古洛糖醛酸(G)以及其C5差向异构体p．D．甘露糖醛酸(M)组成的共多聚体ll】。海藻酸用途广泛，在食品，饮料，造纸和印刷，生物材料及制药工业中，是不可缺少的稳定剂，胶粘剂和胶体添加剂。海藻酸酶L21，亦称为海藻酸裂解酶，依据其对富M 或富G的海藻酸的不同剪切作用分EC4．2．2．3，聚(M)酶[(1—4)．p．D-甘露糖醛酸酶]或EC4．2．2．1．1，聚(G)酶[(1—4)一a—L一古洛糖醛酸酶]。海藻酸酶利用p一消除作用催化海藻酸降解，切割位点在单体间的1— 4o．糖苷键，于六元环上的GO与C5之间形成双键，4．O．糖苷键被消除，海藻酸被降解，同时在非还原性末端产生4．脱氧．L-异丙基．4．enopyranosy．1uronic-六元环型酸。海藻酸酶已被广泛运用于海藻原生质体的制备，食品及海洋经济动物养殖的研究，对海藻酸进行的深入研究，将有利于制造有特殊用途的精细产品l3】。海藻酸酶还可能与化疗药物相结合，用于治疗囊性纤维增生病。本研究从海洋资源中筛选得到能产生海藻酸酶的菌株，进而对其发酵条件进行探讨。

 1 材料和方法
1．1 主要培养基
1．1．1 分离纯化培养基
硫酸氨0．5 g，K2HPO4 0．2 g，NaCI 3．0 g，MgSO4·7H2O 0．1 g，FeSO4‘7H2O 0．001 g，褐藻酸钠1 g，琼脂2．0 g，蒸馏水100 mL，pH7．5。
1．1．2 发酵培养基
蛋白胨0．5 g，酵母提取物0．1 g，褐藻酸钠0．5 g，NaC1 0．5 g，蒸馏水100 mL，pH7．5。
1．2 菌株的分离与纯化u】
剪取小段海带，镊取其病烂部位的较小叶片，在无菌海水中漂洗3次，然后分别贴在分离纯化培养基平板上。将培养基置于23℃ 恒温培养48 h，再利用梯度稀释进行菌株的分离与纯化。选取l1个生长较好的单菌落，编号为1(1)，2(1)，3(1)，4(1)，5(1)，6(1)及1(2)，2(2)，3(2)，4(2)，5(2)，做梯度稀释(至10 倍)，然后10一，10一，10 倍分别取0．2、0．3 mL，滴于分离纯化培养基上，用涂布器铺匀，置于23℃ 恒温培养。

   1．3 液体菌种培养
将上述11株菌，分为两批。分别接一环菌种
于20 mL发酵培养基中(100 mL三角瓶)，23℃
摇瓶培养12 h。
1．4 产酶的发酵实验
每批均在100 mL三角瓶中，装入pH 7．5的
发酵培养液30 mL，并且按照2．5％ 的接种量接入
液体菌种，于25℃ 下恒温摇瓶培养144 h，测定发
酵液的酶活力。
1．5 标准曲线的绘制
参照3，5一二硝基水杨酸法测定纤维素酶活力的方法[引。称取干燥至恒量的葡萄糖醛酸100 mg，溶解定容至100 mL。分别吸取0．2，0．4，0．6，0．8，1．0 mL的葡萄糖醛酸溶液于5支比色管中，同时吸取1．0mL蒸馏水于另1支作空白，其他均用水稀释至1 mL。再分别加入3 mL的3，5．二硝基水杨酸显色剂，于沸水中煮沸显色15 min，冷却，各加入蒸馏水定容至25 mL，摇匀，用722S型分光光度计于350 nrn处测光密度。取平均值，以光密度为纵坐标，葡萄糖醛酸毫克数为横坐标，绘制标准曲线，见图1。

1．6 酶的活力测定
3，5一二硝基水杨酸法测定酶活力，利用比色法测定酶解后还原产物的生成量，以表示酶的活力。具体为：吸取1 mL发酵液，2 mL 1％褐藻酸钠溶液(pH7．0的1／15N 的磷酸缓冲液配制)，于试管中混匀，并且，以1 mL蒸馏水替代发酵液做空白对照实验。置于40摄氏度水浴糖化30 min，取出后立即于沸水中煮沸15 min使酶失活。冷却，过滤，吸取1 mL滤液于比色管中，加入3．5一二硝基水杨酸显色剂3 mL，再沸水浴15 min，冷却，用蒸馏水定容至25 mL，混匀，在550 nm下测光密度(用蒸馏水调零)。酶活力单位定义为，在实验条件下，每毫升酶发酵液每分钟催化底物生成1 g还原糖所需的量。