碱性脂肪酶高产菌株产酶条件的优化研究
2006-09-17 17:12:18   来源：不详   评论：0 点击：

脂肪酶(EC3．1．1．3)是一类重要的水解酶，已广泛应用于食品、轻纺、皮革、香料、化妆品、洗涤剂、有机合成、医药等领域⋯1。自20世纪80年代以来，随着脂肪酶研发与应用不断拓展，碱性脂肪酶的应用已扩展到洗涤剂和绢纺除油等行业。相关报道日益增多，作者曾报道从绢纺厂蚕茧腐化水中筛选诱变得到的一株产碱性脂肪酶的高产菌株——酵母菌yz一145，所产碱性脂肪酶酶活力高于国内资料所报道的菌株_2~5 J。有关菌株的产酶条件的优化研究是筛选高产菌株的关键，受到广泛重视。然而，不少学者所采用的优化手段大多是单因素试验，或是在单因素试验的基础上采用正交试验补充考察氮源、碳源间的交互效应。由于影响液体发酵产酶的因素较多，各因素之间又有可能存在交互作用。这些方法仅能比较各因素已选定水平的优劣，无法提供未考察区域的信息和各因素之间的交互协同作用。因此，越来越多的学者开始寻求一些其他的方法来优化产酶条件。Plackett—Bunnan(P-B)法和响应面分析法(RSM)日益受到重视，这两种方法有可能弥补以前微生物培养优化方面的一些不足，并被广泛应用于生物技术的众多领域_6，7 J。本研究在单因素试验的基础上【引，采用P-B设计和RSM法对影响碱性脂肪酶液体发酵的诸多因素进行进一步考察和评价，拟确定最优的发酵条件，以便提高生产上碱性脂肪酶的产量，为碱性脂肪酶高产菌株的筛选提供理论依据。

1 材料与方法
1．1 菌种
酵母菌菌株yz一145，从浙江桐乡绢纺厂蚕茧腐化水中分离获得，经紫外线和硫酸乙酯诱变选育5代后获得。
1．2 培养基
斜面培养基：1 I~BX麦芽汁培养基。种子培养基(％)组成：蚕蛹粉2．0，蔗糖1．0，(NH4)2804 0．5，MgSO4。7H2 0．2，K2HPo 0．05，自然水pH。发酵培养基(％)组成：蚕蛹粉5，蔗糖1．0，橄榄油0．5，(NH4)2SO4 0．5，MgSO4·7H20 0．2，K2m 0．05，自然水pH。
1．3 产酶条件菌株经活化后，接入液体种子培养基，在30oC，180 r／min的摇床培养8 h后，种子液按一定比例接种至液体发酵培养基，于选定温度下转速为180 r／min的摇床上培养48 h。
1．4 酶活力测定方法
以橄榄油为底物，1 ml酶液在pH 9．8，温度37cI=，酶活单位定义为在上述条件下，以每min产生1 tanol脂肪酸的酶量，定为一个脂肪酶活力单位[。 。
1．5 试验设计
1．5．1 Plaekett—Burman(P-B)法筛选影响产酶的重要因素Plackett—Burman(P-B)法【mJ是一种近饱和的2水平试验设计方法。它基于非完全平衡块原理，能用最少试验次数估计出因素的主效应，从众多的考察因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素供进一步研究。该方法数据处理简单，与目前常用的部分因子试验和随机平衡试验相比，该法筛选重要因素最为高效、准确 J。本试验选用M：16的P-B设计，包括培养基组成和培养条件在内的11个较为重要的因素进行讨论。并且把每个因素设计成高(+)和低(一)两个水平。依据P-B设计中的M次试验最多有M一1次，本试验为了增加准确性，在11个因素中设计了4个空项，并分别计算各因素在高、低水平时试验响应的均值，并求其之差就可得到此因素的效应，其中空项效应的均方和为标准差估计值。各因素效应进行t检验，选择可信度较高的因素作为重要因素作进一步考察[6] 6。具体试验设计见表1，各因素所代表的参数、水平见表2。
1．5．2 响应面分析方法(RSM)Box-Behnken响应面分析(RSM)法 是一种寻找多因素系统中最佳条件的数学统计方法。依据P-B试验分析结果，BoxBehnken设计法每个因素取三个水平，根据相应的试验表进行试验后，对数据进行二次回归拟合，得到包括一次项、平方项和交互项的二次方程，分析各因素的主效应和交互效应，最后在一定水平范围内求取最佳值，其中酶活力(U／m1)为响应变量。
2 结果与分析

2．1 影响碱性脂肪酶产生的重要因素按试验设计进行2轮发酵，发酵48 h时取样测定酶活力并取2次测量值的平均值(表1)，分别计算各因素效益及重要性评价(表2)。由表2可知，对产酶有显著影响(可信度>9o％)的因素包括K2HP0 、橄榄油、发酵温度，其中K2HP0 和橄榄油对产酶呈现出负的效应，发酵温度呈现出较大的正效应，其它因素的变化对产酶的影响不明显。
2．2 响应面分析优化产酶条件以可信度高于9o％的3个因素(K2HP0 、橄榄油、发酵温度)为自变量，发酵酶活力为响应值。
采用RSM法在3个因素3个水平进行优化，其它可信度小的因素说明对产酶影响较小，维持在较低水平上，3个因素与水平的选取如下：K2 (X1)：一1：0．02％ ，0：0．05％ ，1：0．08％橄榄油( 2)：一1-0．3％ ，0：0．5％ ，1：0．7％发酵温度( )：一1：28oC，0：30oC，1：32oC结果见表3。将试验数据进行回归拟合，可得酶活力响应值(y)与各因子( l， 2， 3)之间的下列函数关系：Y = 1759．56+22．81 l+79．67X2+9．3X3— 49．59X】 一67 ．54X2 一1．12X3 一19．67XlX2+1．52XlX3—2．51X2X3 式1
用Box的complex algorithm法对上述回归方程在一2<Xi<2(Xi：1，2，3)的范围内求取最大值，解得各因素的取值为X =0．017， 2=0．326，X3=一2．013，相当于K2Hl~4为0．061％，橄榄油为0．475％ ，发酵温度为31℃。此时模型预测的最大产酶量为1 818 U／nd。为了检验模型预测的准确性，在最佳发酵条件和原始发酵条件时分别进行发酵试验，所得实际产酶量分别为1 776 U／ml和1 421 U／ml。可见该模型较好地预测了实际发酵情况。另外从回归方程各项的方差分析还得出，方程的一次项、二次项的影响均为高度显著，而且交互项的作用也是显著的，这说明各因子对响应值的影响并不是简单的线性关系，而且各因子之间存在一定的交互作用。

3 讨论
本试验结果表明，优化后酶产量高达1 776u／Ⅱd，较之yz．145菌株单因素试验最大酶产量(1 615 U／m1) J，提高了10％。可见，Plaekett．Burman(P．B)法和响应面分析法(RSM)优化发酵条件是一种行之有效的方法，与实际发酵情况吻合较好，且可以有效的从众多影响碱性脂肪酶发酵的因素中筛选出比较重要的影响因素并实现其水平优化，较大地提高了酶产量并简化了试验。优化后yz．145菌株碱性脂肪酶发酵生产最佳培养基组成为：蚕蛹粉5．000％ ，蔗糖1．000％ ，橄榄油0．475％，(NH4)2504 0．500％ ，Mg．SO4·7H2O 0．200％，K2HPO4 0．061％。最佳发酵条件：发酵温度为3l℃，培养基起始pH 9．0，摇瓶转速180 r／min，接种量为4％。