青贮饲料中优良乳酸菌的分离鉴定
2010-12-06 20:20:17   来源：本站原创   评论：0 点击：

摘 要 试验从12种不同来源的青贮饲料中分离到25株乳酸菌，依据伯杰氏系统细菌学手册的标准和描述，把25株乳酸菌都鉴定到了属的水平，有17株乳酸菌鉴定到种的水平，其中：玉米乳杆菌2株、布氏乳杆菌4株、短乳杆菌4株、戊糖乳杆菌3株、干酪乳杆菌1株、粪肠球菌1株、坚强肠球菌2株。其余的8株乳酸菌根据本研究的结果还无法确定其种的归属。测定同时已鉴定的17株乳酸菌的产酸速率，结果发现，Sld2-1、Ssd3、Shw3-7和Ssm3-1都表现出较强的产酸能力。
    关键词 青贮饲料；乳酸菌；分离鉴定

1 前言
    青贮饲料是把青饲料切碎，装入青贮塔或青贮窖内密封，经过微生物发酵而制成的一种耐贮存和适口性好的饲料，是反刍动物最重要的粗饲料来源之一。玉米青贮的质量直接影响到反刍动物的生产性能及生产者的经济效益，而青贮饲料质量的好坏又同它所含有的乳酸菌有很大的关系。乳酸菌是在工业上有重要意义的一类微生物，在轻工、食品、医药及饲料工业等许多行业都有广泛的应用。从越来越多相关领域的研究中也可以反映出乳酸菌的重要性，而且很多国家的政府和企业都已经意识到了乳酸菌的经济意义。欧盟委员会和一些商业机构已经对乳酸菌的长期研究和利用进行了大量的资金投入。乳酸菌在饲料工业中起着重要的作用，尤其是在青贮饲料制备这一领域，已经有很多国家如欧盟国家和美国的研究者对乳酸菌在青贮饲料制备中的应用进行了大量深入的研究。研究内容包括性状优良乳酸菌的筛选，主要有肠球菌、乳酸乳球菌、明串珠菌、链球菌和乳杆菌等（Cai Yimin等，1999）；乳酸菌对青贮饲料发酵品质的影响；添加乳酸菌的青贮饲料对奶牛采食量的影响以及乳酸菌对青贮饲料二次发酵的抑制作用等（Weinberg等，1999）。我国在青贮添加剂技术的研究与应用方面十分薄弱，迫切需要加强。发酵促进型乳酸菌添加剂在玉米秸秆青贮饲料中的研究报道很少见，生产实践应用的添加剂大多是营养型添加剂。因此，针对我国的具体情况，开展这一领域的研究十分必要。
    本研究的目的是从自然发酵的优质青贮饲料样品中分离乳酸菌，对其进行鉴定，并从中筛选出性状优良的乳酸菌，为制备优良的青贮饲料专用发酵剂奠定基础。
2 材料和方法
2.1 材料
2.1.1 样品来源
    从黑龙江省共12处农场和畜牧公司的青贮窖中采集样品。
2.1.2 标准菌株
    瑞士乳杆菌（L.casei），代号为ATCC15009；嗜酸乳杆菌（L.acidophilus），代号为ATCC4356；乳酸乳球菌乳酸亚种（Lc.lactis subsp.lactis），代号为ATCC19435。
2.1.3 仪器设备
    光学显微镜（OLMPUS）、梅特勒-托利多Delta320pH计、电热手提式压力蒸汽灭菌器、恒温培养箱、超净工作台。
2.1.4 各种培养基与试剂
    运动性试验、明胶液化试验、七叶苷水解试验的培养基以及MRS培养基均是根据凌代文（1999）介绍的方法配制；吲哚试验培养基是按照中国科学院微生物研究所细菌分类组（1978）介绍的方法配制；H2S产生试验、硝酸盐还原试验以及各种碳水化合物水解试验的培养基均是购于浙江省杭州天和微生物试剂有限公司生产的细菌微量生化反应管；各种生化试剂和染色液均是按照文献（凌代文，1999；杜连祥等，1992）的方法配制。
2.2 方法
2.2.1 样品的制备
    用四分法均匀采取优质的青贮样品200g左右于密封袋中，并封好放入冰盒内，带回实验室于4℃冰箱中保存备用。
2.2.2 乳酸菌的分离与纯化
    在无菌室中称取1～12号青贮饲料样品各10g，分别置于装有15ml灭菌生理盐水的大试管中浸泡2h，然后用生理盐水适当稀释，选3个稀释度，每个稀释度取0.1ml分别涂布SL和M17平板，在37℃下培养24～72h，然后挑取典型菌落，进行革兰氏染色、镜检。凡是革兰氏阳性的菌株，继续分离纯化培养，纯化后的菌株接种到MRS斜面培养基培养后，置4℃冰箱中保存备用。
2.2.3 乳酸菌属的鉴定试验
    根据文献（凌代文，1999；中国科学院微生物研究所细菌分类组，1978；杜连祥，1992；敖敦格日勒，2001a、2001b；贺银凤，2002）介绍，凡是革兰氏阳性、过氧化氢酶试验阴性的菌株初步确定为乳酸菌，然后进行乳酸菌属的鉴定试验。乳酸杆菌属的确定需要做硝酸盐还原试验、明胶液化试验、吲哚试验、H2S产生试验及pH值4.5的生长试验。乳酸球菌的鉴定还需做温度试验、耐盐性试验、葡萄糖产气试验等来区分肠球菌属、链球菌属、乳球菌属、片球菌属和明串珠菌属。
2.2.4 乳酸菌种的鉴定试验
    根据文献（凌代文，1999；中国科学院微生物研究所细菌分类组，1978；杜连祥等，1992）介绍，乳酸菌种的鉴定主要是根据供试菌株对碳水化合物的发酵产酸试验，即通过对单糖、二糖、三糖、多糖以及糖苷和糖醇类等碳水化合物的利用情况来区分。
2.2.5 用于制作青贮饲料发酵剂的优良乳酸菌筛选试验
    将分离并鉴定的17株乳酸菌分别按3%的接种量传入MRS液体培养基中，37℃恒温培养。每隔2h测定不同菌株发酵液pH值，绘制的产酸速率曲线是不同发酵时间（h）所对应发酵液pH值的变化。根据不同菌株的产酸能力以及产酸速率来筛选适宜用作青贮饲料的菌株。
3 结果与讨论
3.1 乳酸杆菌属种的鉴定结果
    供试菌株的属种鉴定结果见表1。有21株菌被确定为乳酸杆菌属，它们都能在15℃和45℃条件下生长。其中Ssd3、Ssd1-1都能利用葡萄糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖、纤维二糖、半乳糖、果糖、甘露糖、松三糖、水杨苷产酸，不能利用蜜二糖、棉籽糖、阿拉伯糖、山梨醇产酸，不能水解七叶苷，与玉米乳杆菌的性质相近，但二者能利用木糖产酸（酸性较弱），与模式菌株有差别。Ssd2-1、Ssd2-3、Sld1-2、Sld2-1异型发酵，都能利用葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、蜜二糖、松三糖产酸，不能利用纤维二糖、甘露糖、山梨醇、水杨苷产酸，与布氏乳杆菌的性质相近，但Ssd2-1、Sld1-2不能利用麦芽糖产酸，与模式菌株有差别。Slm1-3能利用葡萄糖、甘露醇、纤维二糖、半乳糖、果糖、甘露糖、松三糖、山梨醇产酸，不能利用蜜二糖、棉籽糖产酸，能水解七叶苷，与干酪乳杆菌的发酵性质相近，但其能利用木糖、阿拉伯糖产酸（酸性较弱），与模式菌株有差别。Stj1-1、Stj2-1、Shw3-3、Shw3-6异型发酵，能发酵葡萄糖、果糖、麦芽糖、阿拉伯糖、蜜二糖产酸，不能利用纤维二糖、甘露糖、松三糖、山梨醇产酸，与短乳杆菌的性质相似。Shj1-3、Shj1-4、Sks3-5都能利用葡萄糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖、纤维二糖、半乳糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、蜜二糖、山梨醇产酸，能水解七叶苷，与戊糖乳杆菌的性质相近，但3株菌都不能利用棉籽糖产酸，与模式菌株有差别。Sld3、Sfq2-2、Sfq3-1、Sfq3-3、Shw4-1、Shj1-1、Shj1-5还无法确定它们属于哪个种。在分离菌株中Ssd3、Ssd1-1能利用木糖产酸，Slm1-3能利用木糖、阿拉伯糖产酸，与模式菌株有差异，这可能是由于分离菌株长时间生长于青贮饲料中，已经适应于青贮饲料的生长环境，而木糖和阿拉伯糖则广泛地存在于许多植物中，从而能利用木糖或阿拉伯糖产酸。

3.2 乳酸球菌属种的鉴定结果
    在本研究中共分离得到4株球菌，鉴定结果见表2。

    有3株被确定为肠球菌，1株为片球菌属。其中Slm1-5，Ssm3-1，Shw3-7能在10℃、45℃温度下生长，耐6.5% NaCl，被确定为肠球菌属。Slm1-5，Ssm3-1不能利用甘露醇、木糖、阿拉伯糖、蜜二糖、棉籽糖、松三糖、山梨醇、山梨糖产酸，与坚强肠球菌的性质相似；Shw3-7能利用乳糖、甘露醇、松三糖、山梨醇产酸，不能利用木糖、蜜二糖、棉籽糖产酸，与粪肠球菌的性质相似。Slm3-4的细胞呈四联状排列，在对各种碳水化合物的发酵试验中，只能利用单糖（葡萄糖、果糖、甘露糖）产酸，不能利用山梨醇和淀粉，而且不能从葡萄糖产气，确定为片球菌属，但不能确定其属于哪个种。
    由于在自然发酵的青贮饲料中，乳酸菌的种类和菌数都很少，而且在发酵成熟的青贮饲料中的主要是乳杆菌，存在的乳酸球菌非常少（Lin，1992）。因此，本研究从12种不同来源的青贮饲料中仅分离得到5种乳酸杆菌，2种乳酸球菌。
3.3 产酸速率测定结果
    如图1、图2所示，球菌中Ssm3-1和Shw3-7菌株产酸性能较好，其中Ssm3-1菌株的产酸能力最强，10h左右pH值就能达到3.6。杆菌中Ssd3和Sld2-1菌株的产酸性能较好，14h左右就能达到很低的酸度，尤其是Ssd3菌株的产酸能力非常强，14h左右pH值能够降低到3.22。产酸速度是乳酸菌活力良好的重要特征之一，不同菌株间存在较大的差异。在青贮饲料制备过程中pH值的快速并且大幅度的降低能够显著抑制青贮玉米原料中的那些对青贮饲料品质有不良影响的微生物，如丁酸菌、丝状真菌、酵母及霉菌的生长，从而提高青贮饲料的品质。因此球菌Ssm3-1和Shw3-7，杆菌Ssd3和Sld2-1，可被用来制作优良的玉米青贮发酵剂。

4 结论
4.1 本研究从12种不同来源的青贮饲料中分离到25株乳酸菌，将其中的17株鉴定到种：玉米乳杆菌2株、布氏乳杆菌4株、短乳杆菌4株、戊糖乳杆菌3株、干酪乳杆菌1株、粪肠球菌1株、坚强肠球菌2株。
4.2 从已鉴定的乳酸菌中，筛选出了产酸性能较好的球菌Ssm3-1和Shw3-7菌株、杆菌Ssd3和Sld2-1菌株。在MRS液体培养基中，球菌Ssm3-1和杆菌Ssd3产酸速度很快，球菌Ssm3-1，10h的pH值达3.6；杆菌Ssd3，14h的pH值达3.22。可用来制作青贮饲料发酵剂。（刘 飞　杨丽杰 侯俊财 国立东 霍贵成）