发酵法制备木糖醇的研究进展
2007-11-21 23:24:39   来源：杭州化工   评论：0 点击：

　　木糖醇是一种具有营养价值的甜味物质,也是人体糖类代谢的正常中间体。在自然界中,木糖醇广泛存在于各种水果、蔬菜中,但其含量很低。商品木糖醇的发热量、甜度跟蔗糖相仿,食用后不消耗胰岛素,另具有特殊的防龋功能,可作糖尿病人的营养剂、治疗剂及儿童防龋食品。木糖醇还具有类似甘油和其他多元醇的许多优异特性,因而广泛应用于国防、医药、化工、皮革、涂料及食品等行业[1]。
木糖醇的化学名称为1,2,3,4,5—戊醇,分子式为C5H12O5。木糖醇是白色结晶或结晶性粉末,极易溶于水(约160 g/100mL),微溶于乙醇和甲醇,熔点92~96℃,沸点216℃,热值16.72 kJ/g(与蔗糖相同)。它溶于水是吸热反应,故以固体形式被食用时在口中会产生愉快的清凉感,其10%的水溶液pH值为5.0~7.0[2]。木糖醇的生产方法可分成三种提取、化学合成、生物合成。目前,木糖醇工业生产主要采用化学合成法。生物合成法是利用微生物中的还原酶来生产木糖醇,它可有效降低木糖醇的生产成本。发酵法不仅有可能省去木糖纯化步骤,还可以简化木糖醇的分离步骤,是一种很有前途的生产方法[3]。有研究者试图将细胞固定化技术用于木糖醇的生产,通过采用细胞固定化技术,常可以使成批培养变成连续培养。本文主要介绍发酵法制备木糖醇及制备中的影响因素。
1　发酵法制备木糖醇的微生物
1.1细菌
只有很少一部分细菌能够产生木糖醇,如nterobacter Liquaefaciens, Myobactenum smeg-matis,棒状杆(Corymebacterum sp.)等种属可将木糖转化为木糖醇。M.smegmatis将木糖转化为木糖醇的能力较强,转化率可达70 %。将大肠杆菌置于木糖初始浓度为100g/ L的培养基中进行发酵,木糖醇的生产速率达到0.35g/ (L·h)。大多数细菌含有木糖异构酶,这种酶能将木糖转化成木酮糖。木酮糖在木酮糖激酶的作用下,进一步磷酸化成5 -磷酸- D -木酮糖,而后进入磷酸戊糖途径或通过5 -磷酸木酮糖磷酸酮酶作用,生成3 -磷酸甘油醛和乙酰磷酸。棒状
杆菌属的菌株能够代谢生成木糖醇,这些菌株体内可能存在着一种酶的氧化还原系统———同木糖异构酶并存或代替木糖异构酶的作用[3]。这个体系能够进行木糖还原反应生成木糖醇,然后再进一步氧化生成木酮糖。木糖醇只是细菌代谢的一种中间产物。
1.2霉菌
有一些霉菌也能发酵木糖产生木糖醇。在含有木糖的培养基中,一些丝状真菌,如青霉、曲霉、根霉、胶杆菌、Byssochlamys、漆斑红菌或Neu-rosporaspp. ,能够产生低浓度的木糖醇。在木糖最初浓度为50g/ L培养基中对Fusarium xyspo-rum菌株进行2天的有氧培养后,可检测到木糖醇(<1g/L)。Petromyces albertensis菌株在木糖初始浓度为100 g/L的培养基中培养10天后,木糖醇和木酮糖浓度分别达到39.8 g/L和2.8 g/L[4]。

1.3酵母
在微生物中,酵母转化木糖生产木糖醇的能
力较为优越。Candida属酵母转化能力较强,如
C. guilliermondii, C. tropicalis, C. mogii, C.
parasilosis[1]。其它转化能力较强的酵母有:
①Debaryomyces属,如D.hansenii;
②Pachysolen属,如P.tannophilus;
③Saccharomyces属;
④Schyzosaccharomyces属。
2　发酵法制备木糖醇的影响因素
2.1通气量的影响
在酵母的木糖需氧代谢中, D-木糖由NADPH依赖的木糖还原酶还原为木糖醇,再由NAD+依赖的木糖醇脱氢酶氧化为木酮糖,然后木酮糖再被ATP依赖的木酮糖激酶磷酸化为5-磷酸木酮糖进入磷酸戊糖途径[5]。在好氧条件下,糖的消耗主要用于菌体的生长,而在微好氧条件下,大部分的木糖转化为木糖醇,因而酒精的产量很小。木糖代谢中木糖还原酶还原木糖需要NADPH,而木糖醇脱氢酶氧化木糖为木酮糖需要NAD+,在微好氧的条件下,DADH过量产生,从而阻碍了木糖醇的氧化,促进了木糖醇在发酵液中的积累。在水解液的发酵中,随着通气量的增大,菌体量也随着增大,但过大的菌体量会导致木糖的消耗主要用于产生菌体。另一方面,大的通气量却有利于抑制性物质(如葡萄糖和乙酸)的消耗。乙酸不仅会干扰细胞膜对木糖的吸收,而且会抑制木糖还原酶的活性及其合成。葡萄糖的无氧发酵也会阻碍木糖发酵产生木糖醇。在用Candidaguilliermondii,以1.25 L罐连续培养发酵蔗渣水解液时,氧传速率从10 h-1上升到30 h-1时,发现细胞的数量随着通气量的增加而直线上升。但木糖醇的产率在20 h-1时达到最大(比10 h-1时大8%),当氧传速率从20 h-1上升到30 h-1时,木糖醇的产率急剧下降(约为最大值的1/3)。Preziosi Belloy等采用Candida guilliermondii分两阶段来发酵山杨木半纤维素水解液,第一阶段先采用较大的通气量和搅拌速度,以利于菌体的生长,获得适中的菌浓度,第二阶段再减小通气量和搅拌速度,在微好氧的条件下转化木糖为木糖醇,可以达到80%的木糖醇转化率与0.6 g/(L·h)的生产速率[6]。
2.2木糖浓度的影响
培养基中的木糖浓度,会显著影响木糖醇的产量。在不增加通气量的情况下,木糖浓度水平的提高会引起生长率的降低,这说明木糖浓度过高会抑制细胞的生长。较高的木糖初始浓度,有利于耐高渗微生物的木糖醇生产。低木糖浓度会使转化率下降,因为这时一部分碳源将用于细胞的生长,从而减少了用于转化的木糖。一般来讲,在批量处理中,如果微生物能够耐受高浓度的糖分和高渗透压,初始糖浓度的增加能提高生产速率和转化率[3]。木糖初始浓度为20~50 g/L时,C.guiller-mondii菌株的最大生长率μmax达到最大值。对C. mogii菌株的研究表明,μmax达到最大时的木糖初始浓度为5~10 g/L。将木糖初始浓度从100 g/L增加到150 g/L,在较高的通气量条件下培养C. tropicallis,细胞生长旺盛,木糖醇生成速率从1.78 g/(L·h)提高到2.44 g/(L·h)。在P.tannophilus、C. tropicalis和C. guilliermondii等菌株的发酵过程中,最适初始木糖浓度各为60、200、100和200 g/L。当初始木糖浓度增加5倍时,产物转化率增加5.5倍,同时单位培养基消耗和产物的合成量也有提高。P.tannophilus菌株在木糖浓度高于10g/ L时积累木糖醇,较低的木糖浓度(5~8g/ L)和流加培养对乙醇的产生更有利,而对木糖醇生产不利[5]。P.tannophilus和啤酒酵母(S. cerevisiae)菌株的木糖醇产量,随着木糖浓度的提高而提高。在Petromycesal-bertensis菌株的木糖醇生产过程中,木糖醇转化率在木糖浓度100 g/L时达到最高峰,超过150g/L则开始下降。这可能是由于渗透压对细胞的响,或者是基质对D-木糖代谢酶的负作用[4]。
2.3葡萄糖含量的影响
葡萄糖的存在,是影响酵母发酵木糖生产木糖醇的一个关键因素[1]。Sang等在Candida parapsilosis发酵木糖和葡萄糖的混合液时,葡萄糖先被消耗,这样在木糖被利用前就有个延滞期以合成木糖代谢所必需的酶。葡萄糖含量低于5g/L时,木糖醇的产量不会降低,因为葡萄糖进行的是有氧代谢,不产生乙醇。而当葡萄糖的浓度大于5 g/L时,有氧代谢消耗不掉的部分便通过无氧代谢而产生乙醇,木糖醇的产量降低。他们认为,由于木糖生成木糖醇和葡萄糖生成乙醇的反应均为还原反应,会竞争氧化还原势,从而当葡萄糖超过一定的量,发生无氧代谢产生酒精时就
会抑制木糖醇的生成。也有人认为,葡萄糖的存在可能会抑制将木糖转化为木糖醇过程中的关键酶木糖还原酶的活力,从而导致木糖醇的产率降低。章克昌等采用活性干酵母消耗掉水解液中的葡萄糖,可以大大提高水解液的发酵速度和木糖醇的转化率[1]。
2.4接种量及种子龄的影响
接种量的提高可以增加菌体对水解液中有害物质的消耗。有人尝试通过加大接种量来克服只采用活性炭吸附处理的水解液中有害物质的抑制作用。Parajo等在Debary omyceshansenii接种量达到50~80 g/L时,用含木糖58~78 g/L的水解液可以发酵得到39~41 g/L的木糖醇浓度,木糖的利用率可达92%,当采取菌体重复利用时,这种方法还是可行的。Martin等发现在用Candi-da guillermondii发酵时,菌龄只对木糖醇的生产速率起作用,而对木糖的转化率没有影响[5]。
2.5发酵方法的影响
Denise等人发现在间歇、流加(培养65 h后以28 mL/h加入含木糖79 g/L的水解液)、半连续培养(培养至63 h时移去2/3的培养物,再补入水解液)3种方式中,半连续培养的最大木糖醇浓度和生产速率均大大高于间歇培养和流加培养,木糖醇的浓度最高可达34 g/L,转化率为79%[6]。这是由于采用半连续培养使细胞进一步适应了水解液,从而提高了转化率和生产效率。
2.6氮源的影响
木糖醇的积累受氮源的影响显著,适宜的氮源及浓度在不同培养基,不同pH条件及酵母菌株之间存在很大差异。有机氮源可降低C.Shehatate XDH水平。酵母膏是最好的有机氮源。用稻草半纤维素水解物培养C. guilliermondii,在pH 4.5时用尿素作氮源比硫酸铵好,木糖醇转化率提高25%,而在pH 5.3、pH 6.0的条件下,则这两种氮源无明显差异[7]。一些学者混合使用有机氮与无机氮源,取得很好的效果。
2.7 pH值和温度的影响
pH值和温度会影响木糖醇发酵的两个关键酶木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的活力。Sene等人的研究发现,对于Candida guilliermondii发酵蔗渣水解液时,pH 4.0到pH 6.0时木糖还原酶的活力最高,而木糖醇氧化酶的活力随着pH和温度的上升而上升,在pH 6.5和35℃时木糖醇脱氢酶的活力最高。而木糖的转化率和木糖醇的生产速率均在pH 6.0和温度35℃达到最大,同时木糖醇的存在对于此种菌的木糖醇脱氢酶的活力没有影响,由此可见木糖醇的最佳生产条件与使木糖醇脱氢酶活力最低及木糖还原酶的活力最高的条件并不一致[4]。由于氮源在发酵过程中的分解会使发酵过程中的pH值发生变化,所以使用不同氮源时使木糖醇产率最高的pH值并不相同。如在用Candi-da guilliermondii发酵稻草半纤维素水解液时,若使用硫酸铵为氮源,则产醇的最佳pH值为5.3而使用尿素为氮源时,最佳pH值则为4.5。这是因为在发酵过程中,尿素会分解生成氨和二氧化碳,从而使发酵液的pH升高。因此在考虑最佳的发酵pH值时,也应考虑氮源的因素。
3　展望
细胞固定化技术用于木糖醇的生产是一种很有前景的方法。通过采用细胞固定化技术,常可以使成批培养变成连续培养,同时由于细胞浓度较高,因而能在较长的工艺时间保持稳定的活性使供给细胞的营养物质要比普通工艺少得多,并且由于转化物的不断排出,因而使细胞活性的调节、有毒物质代谢产物的形成以及细胞活性的降低等类似问题都比悬浮细胞工艺更易解决。Roc等使用酿酒酵母的重组体进行了固定化细胞生产木糖醇的实验[8]。他们以藻酸钙作为载体,使用填充床生物反应器所得到的最高发酵生产率是4.5 g/(L·h)。但是有关细胞固定化生产木糖醇的报道还很少,这项研究还处于起步阶段。了解影响木糖代谢产生木糖醇的因素是进一步扩大生产的基础,研究者在这方面做了大量的工作。许多人用摇瓶或小型发酵罐发酵木糖得到了很高的产量。这些工作证明,以发酵法生产木糖醇的前景光明[3]。但至今未有以发酵法大规模生产木糖醇的报道。目前发酵罐的放大技术还停留在经验或半经验状态,亟待进一步研究。