固态发酵产游离氨基酸的条件优化研究
2007-12-17 10:53:19   来源:安徽农业科学   评论:0 点击:

米曲霉(Aspergillus oryzae)属于曲霉菌,除产蛋白酶外,还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等,在蛋白酶的作用下,可将不易消化的大分子蛋白质降解为多肽及各种氨基酸[1]。豆类中丰富的蛋白质及维生素、无机盐等营养物质,能满足米曲霉繁殖和产酶的需要。据有关文献记载,大豆作为培养基不仅是较好的碳源和氮源,而且透气性好,能够满足米曲霉生长代谢的需要[2]。目前,大豆和米曲霉被广泛应用于酱油等发酵食品的生产中,具有较高的经济价值[1]。为此,笔者对曲霉菌株进行固态发酵产酶试验,在此基础上对产氨基酸的培养基成分和培养条件进行优化,旨在提高菌种的发酵产游离氨基酸水平,为工业化生产提供依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种。米曲霉、黑曲霉、毛霉菌种,由江西农业大学生物工程系应用微生物研究室提供。
1.1.2培养基。①菌种培养基。去皮马铃薯20%,葡萄糖2%,琼脂2%;②摇瓶培养基。马铃薯200 g,葡萄糖20 g,水1 000 ml,pH值5;③固态发酵培养基。分别将黄豆、红豆、米豆、豌豆、青豆、黑豆、蚕豆、绿豆、花豆、红云豆、白云豆洗净,浸泡10 h左右。
1.1.3药品及试剂α!丙氨酸标准品(上海钰森生物技术有
限公司提供),正丙醇,正丁醇,异丙醇,乙二醇,茚三酮,醋酸缓冲液,抗坏血酸,醋酸钠,蔗糖(分析纯)。
1.1.4仪器。722型分光光度spectrophotomete(r上海精密科
学仪器有限公司生产),电热恒温干燥箱(上海跃进医疗器械厂生产),低速大容量多管离心机LXJ!IIB型(上海安亭
科学仪器厂),生化培养箱LRH!250A型(广东省医疗器械厂生产),超净工作台(苏净集团安泰公司制造)。
1.2方法
1.2.1菌种活化。配制培养基,分装于250 ml三角瓶中,包
扎封口后,于121℃,0.1 MPa灭菌30 min;冷却后接入曲霉,在转速190 r/min,温度(30±1)℃条件下摇瓶培养2 d。
1.2.2固态发酵培养。将浸泡好的豆类分装于广口瓶中,于
121℃灭菌1 h,按照要求接入曲霉菌种,置于28~30℃培养箱中培养。
1.2.3菌种筛选试验。将浸泡好的黄豆分装于组织培养瓶中,每瓶30 g,包扎封口,121℃灭菌1 h,以10%的接种量
(即3 ml)分别接入活化后的米曲霉、黑曲霉、毛霉种子液,并以空白作对照,各接5瓶,放置于28~30℃培养箱中培养5 d。提取游离氨基酸,并测定其含量,确定最佳的菌种。
1.2.4豆类培养基的筛选试验。各取浸泡好的黄豆、红豆、
米豆、豌豆、青豆、黑豆、蚕豆、绿豆、花豆、红云豆、白云豆各30 g,装于组织培养瓶中,重复3瓶,包扎封口,121℃灭菌1h,然后按10%的接种量接入米曲霉种子液,另外设置2瓶对照。放置于28~30℃培养箱中培养5 d。提取游离氨基酸,并测定其含量,确定最佳的豆类培养基。
1.2.5固态发酵培养条件的优化试验[3-4]。在预试验的基础上,采用正交试验设计L(934)优化米曲霉的培养条件[5]。3个因素分别为米曲霉的接种量、培养基的装料量、培养时间,每个因素设3个水平,按L(934)正交表进行正交试验,各因素的不同水平见表1。

1.2.6游离氨基酸的测定。将发酵后的产物摊开于托盘中,于50℃下恒温干燥2 d,称取干燥样品0.25 g于研钵中,加
入12.5 ml浓度10%醋酸溶液研磨成匀浆,过滤,滤液洗入250 ml容量瓶中并加蒸馏水定容;将定容后的样液稀释一
定倍数,从中取出2 ml,按照茚三酮比色法检测580 nm处的吸光值,由标准曲线获得反应液中游离氨基酸的浓度[2]。
2结果与分析
2.1菌种筛选试验结果(表2)由表2可知,接入曲霉后,游离氨基酸的含量显著提高,说明米曲霉、黑曲霉、毛霉在
生长的过程中都能分泌蛋白酶。其中,接入米曲霉后游离氨基酸的含量的相对提高率为824.9%,接入黑曲霉后游离氨基酸的含量提高354.2%,接入毛霉后游离氨基酸的含量的相对提高率为397.9%。接入米曲霉后游离氨基酸的含量最高为64.65 mg/g。由此得出,在以黄豆为天然培养基时,米曲霉分泌蛋白酶的能力最强,其次是毛霉,最后是黑曲霉。

2.2天然豆类培养基筛选试验结果(表3)由表3可知,11种豆类培养基在接种米曲霉后,其氨基酸的含量明显提高。其中,黄豆、蚕豆、绿豆氨基酸含量提高最大,相对提高率依次为824.9%、785.9%、761.3%;而花豆和红云豆的氨基酸相对提高率为142.1%和55.3%。

2.3发酵条件的正交试验结果(表4)由表4可知,培养时间对游离氨基酸产量的影响最大,其次是装料量,再次是
接种量。最好的生产工艺是A2B2C3,即接种量10%,装料量40 g,培养时间为8 d。经方差分析可知,接种量、装料量和培养时间3因素的各水平之间在0.01水平上有差异,各水平的变化均对最终游离氨基酸的含量有极显著的影响。

根据表4数据,建立X(1接种量)、X(2装料量)、X(3培养时间)对Y(游离氨基酸含量)的直线回归方程:
Y=0.018 0 X1+0.028 5 X2+0.618 3 X3-0.0465 5该方程的决定系数R2=0.787 9,根据计算,X1、X2、X3的
标准化系数值分别为0.062 789 4、0.198 832 7、0.862 771 3,这表明培养时间对试验结果的影响最大,装料量次之,接种量最小。该分析结果与方差分析的结果是一致的。
3结论与讨论
(1)在固态发酵培养中,培养基的含水量对菌体生长和产酶很重要,当培养基含水量在50.0%左右时产酶活力较高。培养基含水量过高,灭菌后培养基结块成团,通气状况差,不利于产酶;培养基含水量过低,对菌体生长造成不利影响,因此控制固态发酵时的湿度尤为重要。
(2)大豆的营养成分中蛋白质含量为35.0%~45.0%,大豆氮素中95%是蛋白氮[6]。按照蛋白质中含氮元素占
16%计算,大豆中总氨基酸含量为5.0%~7.0%,该试验中测得的游离氨基酸含量在2.3%~6.5%。
(3)正交试验理论最佳组合与实际最佳组合相一致,说明该试验具有较强的可信度,且所选试验项目可操作性强,
可在实际生产中广泛应用。由试验结果可知,采用固态发酵的方法,经过对发酵条件的优化设计,可以使游离氨基酸的含量达到更高的水平。

 

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