工程菌生产L-苏氨酸
2006-09-16 22:12:41   来源：本站原创   评论：0 点击：

一、前言
L-苏氨酸是一种必需氨基酸，按世界粮农组织的标准计算，一克食品蛋白质中含苏氨酸40mg，占全部氨基酸的11%。欧美型食品中缺少苏氨酸，补充苏氨酸就能提高食品的营养价值。配合饲料也需要苏氨酸，因此近十年来，苏氨酸生产增长了5.3倍。具统计，1990年全世界苏氨酸产量为700吨/年，1996年增加到4000吨/年，2002年则猛增至35000吨。资料显示，使用植物型饲料，成畜必需添加赖氨酸和苏氨酸，比例为10：1，而幼畜为3：1。按10：1计算,目前全世界苏氨酸的需求量不应低于5万吨/年，缺口为较大。［1］
苏氨酸的生物合成途径及代谢调控机理来看，苏氨酸和赖氨酸一样，同属天冬氨酸族氨基酸。是葡萄糖经糖酵解途径生成丙酮酸，再经三羧酸循环CO2固定反应生成四碳二羧酸，后经氨基化反应生成天冬氨酸。国内外通常用传统育种和基因工程方法来获得苏氨酸的高产菌种，传统育种目前最高产酸为2-3%。在基因工程菌方面，木柱等将解除AKⅠ和HDⅡ反馈抑制的突变株HNr59的Etr-1基因导入产苏氨酸25g/L的T-693菌株,选育出具有6种调节变异组合的转导子T-1026，相同条件下可产苏氨酸40g/L。据日本味之素公司报道，用E.coliK12菌株（AHVr＋Ile－＋Met－＋pro－）含苏氨酸合成酶操纵子基因的质粒转化E.coliK12（Thr－），积累苏氨酸13.4g/L（转化率40%），小罐发酵产酸65g/L，转化率48%。［2］前苏联全苏工业微生物遗传育种研究所的Debabov等构建了大肠杆菌基因工程菌E.coli BKIIMB-3996 工程菌，重组质粒Pvic40中含苏氨酸操纵子的三个基因thr A, thrB, thrC，遗传标记为Sac+（能以蔗糖为碳源）， thr r （抗苏氨酸）和Hser(抗高丝氨酸)，在蔗糖为碳源的流加补料方式，最高产量为85.0 g/L。［3］
综上所述，国内外用传统育种方法的菌种产酸水平在30-40g/L；用基因工程方法的菌种产酸水平在80-90g/L。

二、材料与方法
1. 菌种：E. coli （pTH08+prh-T04）/VT418 (上海新立公司构建)
2. 培养基配方
2.1 斜面培养基(g/l)
葡萄糖 2.0 NH4Cl 1.0 KH2PO4 1.5 Na2HPO4 3.5 MgSO4·7H2O 0.1 琼脂 20.0 加蒸馏水溶解，调pH7.0-7.2，定容1000ml，0.8Kg/cm2灭均30分钟，冷却至50℃左右加入氨苄青霉素溶液，最终浓度为50γ/ml。
2.2 摇瓶种子培养基(g/l)
葡萄糖 40.0 KH2PO4 1.0 MgSO4·7H2O 0.5 (NH4)2SO4 10.0 玉米浆2.0 CaCO3 15 氨苄青霉素 50γ/ml 加自来水溶解，调pH7.0-7.2，定容1000ml，分装至500ml摇瓶，0.8Kg/cm2 灭菌30分钟，接种前加入CaCO3（121℃，60分钟灭菌，烘干）和氨苄青霉素。
2.3摇瓶发酵培养基(g/l)
葡萄糖 80.0 (NH4)2SO4 25.0 KH2PO4 2.0 MgSO4·7H2O 1.0 MnSO4·5H2O 0.5 FeSO4·7H2O 0.5 CaCO3 30.0 加自来水溶解，调pH7.0-7.2，定容1000ml，分装至500ml摇瓶，0.8Kg/cm2 灭菌30分钟，接种前加入CaCO3（121℃，60分钟灭菌，烘干）
2.4 种子罐培养基
葡萄糖4% (NH4)2SO4 1% KH2PO4 0.1% MgSO4·7H2O 0.05% 玉米浆 0.2% 泡敌0.01%。加水溶解pH自然，121℃灭菌20分钟，消后定容400L。接种前加入无菌氨苄青霉素50ug/L。
2.5 发酵罐培养基
葡萄糖8% (NH4)2SO4 2.5% KH2PO4 0.2% MgSO4·7H2O 0.1% FeSO4·5H2O 0.05% MnSO4·5H2O 0.05% 泡敌 0.01%。加自来水溶解pH自然，121℃灭菌20分钟，消后定容5.1M3。1.0Kg/cm2灭菌20分钟。
3. 培养方法
3.1 斜面培养：斜面培养基上划线接种，37℃培养1-2天。
3.2 摇瓶培养：37℃，往复式摇床，冲程89cm，转速120r/m，种子培养24小时，接种量5%，发酵摇瓶培养48小时。
3.3 种子罐培养方法：将成熟摇瓶种无菌状态收集于接种瓶中，用压差法接入500L种子罐。用液氨将pH调至6.8～7.2，并将控制点设定在6.4。中间控制温度37℃罐压0.05 Mpa，转速260rpm，初始风量10 M3/hr。起始溶氧100%，培养过程中溶氧控制不低于15%。一般培养时间在13～15小时。移种条件：产酸0.5～0.7%，残糖1.0～1.5%，OD值0.3～0.4。
3.4 将成熟种子接入10M3发酵罐，初始控制: 温度37±1℃，罐压0.05Mpa ，转速140-240rpm，风量120-540M3/hr ，PH6.4～6.5，溶氧控制不低于10%。当还原糖低于4%时，开始流加50%葡萄糖溶液。理论上流加糖度与消耗糖度相当，一般使发酵液糖度在2～4%之间。后期停止流加，使发酵糖度小于0.5%。
4. 分析方法
4.1 苏氨酸含量：纸层析法。
4.2 还原糖：菲林定糖法。

三、结果与讨论
1. 工程菌种的构建
第一步，解除L-苏氨酸生物合成反馈调节，去除支路代谢的传统方法是采用诱变方法，选育营养缺陷型和代谢类似物抗性菌株；
第二步，强化表达苏氨酸操纵子，将大肠杆菌中苏氨酸合成酶基因thrA、thrB和thrC克隆到质粒pET-11a，并在受体大肠杆菌中表达；
第三步，将苏氨酸分泌相关基因rthB、rhtC克隆到质粒prh-T04，并在受体大肠杆菌中表达。如图一所示：

图1、E. coli （pTH08+prh-T04）/VT418菌种构建示意图

2、pH对发酵的影响
我们通过对发酵pH精密控制，中和剂为氨水，结果如下图所示：

图2、pH对发酵的影响

3、溶氧对发酵的影响
我们选择两批典型的发酵罐批，一批是充分满足溶氧，另一批是不能充分满足溶氧，结果显示：充分满足溶氧的罐批发酵结果明显好于不能充分满足溶氧发酵罐批。说明控制溶氧对苏氨酸发酵是非常重要。

图3、溶氧对发酵的影响曲线

4、典型罐批的发酵结果
4.1 过程曲线

图4、10M3发酵罐典型发酵曲线

4.2发酵液HPLC图谱

图5、10M3发酵罐发酵液HPLC图谱（点击图片可放大）

4.3发酵结果技术参数
10M3发酵罐的发酵结果为：产酸8.5-9.0%；转化率39-41%；周期48-52小时。