产氨短杆菌GMA一1112利用味精母液发酵生产肌苷
2006-09-17 17:04:06   来源：不详   评论：0 点击：

                肌苷是有一定医疗价值的药物．可用于治疗肝脏、心脏疾病，白血球、血小板减少症；中心视神经膜炎、视神经萎缩等疾病及放疗造成的血小球减少症；此外．还可作为合成抗病毒药和食品呈味剂的原料- r 。我国一直采用枯草杆菌发酵法生产肌苷，工业生产中产肌苷率可达20 g／L以上，但生产成本较高，究其原因，除了菌种单一，发酵设备和工艺落后外，采用药用酵母粉为发酵原材料，也是一个重要原因。添加酵母粉，培养基灭菌温度、时间较难控制，易造成污染，发酵液粘度较大，增加离子交换工序的难度．因此通过开展新型菌种的选育和发酵工艺的研究，这对改变我国肌苷生产存在的菌种单一、技术经济指标低的落后面貌有一定意义。本研究通过多种物理、化学方法诱变选育一株产氨短杆菌GMA一1112(A拈+Gua。+VB1+8 AG +sG +6-MP )，该菌株具有生长快、O．D．净增多，遗传性状稳定，能通过在发酵培养基中添加味精母液取代药用酵母粉进行肌苷发酵，放瓶发酵液澄清，镜检菌体完整，摇瓶发酵61 h产肌苷25．40g／L，并能降低发酵主要原材料成本。
1 材料与方法
1 l菌株：
产氨短杆菌(1~revibacterium ammonia．genes)GMA-1112由本实验室诱变获得。枯草杆菌(Bacilus substilis)GMI．526由本实验室诱变获得_3
1 2培养基：
1．2．1菌种斜面保藏培养基(g／L)：蛋白胨4，牛肉膏l4，酵母膏7，琼脂20，plM ．0。1．2 2菌种斜面活化培养基(g／L)：葡萄糖20，尿素4．0，玉米浆6，蛋白胨1O．酵母膏1O，腺嘌呤0 025，琼脂20．pH7．0。
1．2．3菌种液体活化培养基(g／L)：葡萄糖2o，尿素4．0，玉米浆6，蛋白胨l0，酵母膏lO，腺嘌岭0．025，plM ．0。1．2．4枯草杆菌肌苷发酵培养基(g／L)：葡萄糖120，玉米浆lO，酵母粉l6，硫酸铵lO．氯化钾5，磷酸二氢钾1，硫酸镁1，pH 7．0。

l 2．5味精母液：广洲味精食品厂提供．为味精发酵液一次等电点结晶后的上清液，含谷氨酸30 g／L左右。
1．3发酵过程：保藏斜面种经斜面活化培养基活化后，接种于液体活化培养基(装量：20 ml／250 ml三角瓶)，32℃ 、96 r／min水浴摇床振荡培养15 h，按20％接种量接于发酵培养基(装量：20rod／500ml三角瓶)中，用转速96～120r／rain、冲程76 mm往还式摇床．于32～36℃培养60 h。
1．4正交试验设计：采用七因素三水平(b )正交试验¨ (如表1)，分析发酵培养基组成对发酵产肌苷的影响。
l 5肌苷含量测定：纸层析法

2 结果与讨论
2．1产氨短杆茵GMA-1112选育过程以GMA—l为出发菌株，通过亚硝基胍、uv、微波、60Co7辐照等诱变，筛选获得GMA．
1112．选育谱系如下：

采用七因素三水平(I-3 )正交试验(如表1)，分析发酵培养基组成对发酵产肌苷的影响．摇瓶发酵结果列表2。由表l～2可以看出，F因素(味精母液)对发酵产肌苷影响显著，C因素(玉米浆)及B因素(硫酸铵)对发酵产肌苷也有比较大的影响。而D因素(药用酵母粉)对发酵产肌苷几乎没有影响。A因素(葡萄糖)在浓度lo0～12og／L之间影响不大，但因为工业生产实际中所用糖原一般为双酶水解糖，发酵残糖在25-30 g／L左右．所以初糖仍用120 g／L。根据工业生产实际情况，最后确定最佳发酵培养基配方如下(g／L)：A3B3 DlE1 F3G3即发酵糖120，玉米浆30，硫酸铵10．磷酸二氢钾3，味精母液60 硫酸镁1，尿素5(分消)，pH 7．0。采用产氨短杆菌GMA一1112与采用枯草杆菌GMI一526进行肌苷发酵的发酵培养基组成产肌苷率列表3。
从表3可以看出，产氨短杆菌GMA一11l2与枯草杆菌GMI一526的发酵培养基组成差异主要是GMA一1l12不需要药用酵母粉和氯化钾，但需要味精母液，而GMI一526则需要药用酵母粉和氯化钾，但不需要味精母液。由于药用酵母粉占枯草杆菌肌苷发酵主要原材料成本的30％以上，而味精母液则是味精发酵液一次等电后的上清液，含谷氨酸约30 g／L左右，但含有大量的杂质．所以在味精提取中价值不大；而产氩短相菌GMA一1112利用味精母液作为发酵原材料，不仅可以利用其中谷氩酸，且可以利用母液中含有的大量其他氨基酸作为有机营养物．降低发酵成本。从表3也可以看出．GMA一1112利用味精母液代替药用酵母粉进行肌苷发酵．产率比GMA一526用药用酵母粉进行肌苷发酵还要高，且因酵母粉牯度较大，作为发酵原材料时发酵培养基温度、时间较难控制，放罐发酵液粘度大，不利于后提取。因此，产氨短杆菌GMA一1 1l2利用味精母液进行肌苷发酵克服以上缺点，有望应用于工业生产实际中。