Ｄ-丙氨酸的用途及制备方法
2006-09-17 17:03:15 来源：不详 评论：0 点击：
1 前 言
丙氨酸是构成蛋白质的20种基本氨基酸之一,是血中氮的优良运输工具,又是一种有效生糖氨基酸。Ｄ-丙氨酸包含于大的有机组织中,作为细胞壁肽壁糖或肽抗生素。实验证明,Ｄ-丙氨酸在成年狗尿[1],在微生物体中也大量存在,在弯曲乳杆菌的乙醇提取液中含量高达79%,在瑞士乳杆菌中为59.2%[2]。外源性Ｄ-丙氨酸是随血流进入各组织的。
Ｄ-丙氨酸是白色晶体,有特殊的结晶形状。有甜味,溶于水强碱和强酸溶液,不溶于无水酒精,乙醚和丙酮。加热到熔点,分解生成氨,放出二氧化碳。Ｄ-丙氨酸在2%的盐酸(5ｍｏｌ/Ｌ)中25℃比旋光度是-14.6,在2%的水中25℃比旋光度是-1.8。
2 Ｄ-丙氨酸主要用途
2.1 药物应用
Ｄ-丙氨酸是生产维生素Ｂ6的原料,本身就有镇痛作用,1986年国内药用需量为2.6ｔ。它还可以做成输液注射,单剂合剂[3]。在法国,Ｄ-丙氨酸被用做防止颜面潮红的药物。
近年的研究还发现Ｄ-丙氨酸的新的生理活性的应用。Ｄ-丙氨酸可使体内氨基酸氧化酶(ＤＡＡＯ)在肿瘤细胞质中异位表达,阻止体内脂质氧化损伤,清除细胞毒性[4]。Ｄ-丙氨酸还可以抑制致癌物质二甲基亚硝胺(ＤＭＮＡ),抑制效果为72.4。具有伯胺基的Ｄ-丙氨酸能竞争性地替代仲胺与亚硝酸盐生成ＶＡＮＳｌｙｋｅ反应,分解为氮气和有机酸,从而抑制了ＤＭＮＡ的生成。因此有人建议Ｄ-丙氨酸可以作为一种新的癌基因治疗措施。
2.2 食品添加剂
作为丙氨酸的一种立体构型,Ｄ-丙氨酸具有丙氨酸的一些共性,即在食品添加剂方面的应用,主要供增味剂和调味料用,增加化学调味料的调味效果,改善人工甜味剂的味感,改善有机酸的酸味。
另外,Ｄ-丙氨酸本身具有自己的特性,可以应用在功能性食用甜味剂方面。Ｄ-丙氨酸是强甜味,味感值是4,是氨基酸中最甜的一种[5]。而且Ｄ-丙氨酸是合成二肽甜味剂阿力甜(2.2.4.4-ｔｅａ-ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｅｔａｎｙｌａｍｉｎｅ)一种重要的原料。阿力甜甜味品质好,味道纯正,没有异味和不愉快的后味。而且作为一个二肽,阿力甜只部分参与机体代谢,其最大的产热量为1.4ｋｃａｌ/ｇ,相当于相当甜度蔗糖的0.02%,符合人们目前对低热食品的追求。
2.3 化妆品
Ｄ-丙氨酸有抑菌作用,而且是自然保湿因子(ＮＭＦ)的主要成分,是角质层保持水分的重要角色。
3 丙氨酸的制备方法
由于Ｄ-丙氨酸的生理活性和越来越广泛的应用,它的制取已经引起了很大的兴趣。一般氨基酸的制取方法有三种:水解提取法,微生物发酵法,化学合成法。其中水解提取法一般都得到Ｌ-氨基酸,不适用Ｄ-氨基酸的制取。目前用于制取Ｄ-丙氨酸是其他两种方法,微生物发酵法和化学合成法。
3.1 微生物发酵法
Ｄ-丙氨酸可以通过Ｄ-环丝氨酸抵抗变异种的短杆乳酪酵母制得。但是产物浓度低,生产周期长,设备投资大,有副反应,分离较复杂。而且由于丙氨酸的外消旋的活泼性,产物Ｄ-丙氨酸的光学纯度比较低。
3.2 化学合成法
Ｄ-丙氨酸的化学合成方法有两种,一种是利用不对称合成法直接得到Ｄ-丙氨酸,另一种是通过化学合成法得到ＤＬ-丙氨酸的混旋体,再利用各种光学拆分方法,得到Ｄ-丙氨酸。
3.2.1 不对称合成法
目前有3种不对称合成法适用于合成Ｄ-丙氨酸[7]。
(1)Ｋａｇａｎ-ｃｏｒｅｙ合成法。
选择的手性试剂为含有二环的二氢吲哚,如果使用更拥挤的有两个不对称中心的试剂,Ｄ-丙氨酸的光学纯度可以达到96%。
(2)铑(Ⅱ)络合催化法。
该方法应用的催化剂是Ｒｈ(Ｐｈ3Ｐ)3Ｃｌ(Ｗｉｌｋｉｎ ｓｏｎ催化剂),反应机制相当复杂,是底物与催化剂的立体选择性结合。
(3)Ｅｖａｎｓ合成法。
1986年报导的Ｅｖａｎｓ合成法,是用一个非手性的羧酸与光学纯手性试剂缩合,形成一个中间产物。在碱存在下,中间产物发生烯醇化,并且在手性试剂络合作用下,让亲电试剂定向进攻,得到光学纯的手性产物。
不对称合成法需要纯手性试剂或贵金属络合物作催化剂,成本非常高,反应机制很复杂,不能大规模进行生产,不适用于Ｄ-丙氨酸的大规模制取。
3.2.2 间接化学合成法
化学合成ＤＬ-丙氨酸的方法一般有Ｓｔｒｅｃｋｅｒ法,Ｂｕｃｈｅｒｅｒ-Ｂｅｒｇｅ法。目前工业上生产ＤＬ-丙氨酸的方法主要是由乙醛为原料与氰化钠,氯化铵,氨作用合成2-氨基丙腈,再经过水解后制得ＤＬ-丙氨酸。
化学合成法采用多种原料和工艺路线,成本较低,生产规模大,适应于工业化生产。但所得到的产物皆为ＤＬ-混型丙氨酸,必须进行光学拆分,才可以得到Ｄ-丙氨酸。用于分离ＤＬ-丙氨酸的方法是以下几种。
(1)种晶拆分及诱导结晶法。
在ＤＬ-丙氨酸消旋混合物的饱和溶液中加入Ｄ-丙氨酸晶种和少量表面活性剂,控制浓度和温度,使两种对映体的结晶速度产生差异,Ｄ-丙氨酸优先析出结晶。但工艺较难控制,光学纯度较低。
(2)层析拆分法。
应用高效率化的柱和高性能的高效液相色谱或气相色谱。加入稳定且能定量衍生物的光学活性剂Ｎ-三氟乙酰基正丁烷,通过硅胶毛细管,根据光学活性区分开Ｄ-丙氨酸和Ｌ-丙氨酸[8]。
(3)酶拆分法。
酶有非常严格的专一性,对于外消旋体,酶能选择催化其中一种进行反应而对另一种则几乎不催化。反应多在水溶液中,温和的条件下进行。可以高选择性,高收率的获得所需要的光学活性的氨基酸。目前,应用酶拆分ＤＬ-丙氨酸的衍生物得到Ｄ-丙氨酸的主要有两种方法:
一是用米曲氨基酰化酶拆分ＤＬ-乙酰化丙氨酸,得到Ｄ-丙氨酸。
二是用乙内酰脲水解酶拆分ＤＬ-5-取代乙内酰脲,再用脱去氨甲酰基,得到Ｄ-丙氨酸。
①用米曲氨基酰化酶拆分。
米曲酰化酶是由米曲霉产生的胞外酶,专一水解酰化氨基酸的酰胺键。该酶对Ｎ-乙酰-Ｌ-丙氨酸和Ｎ-乙酰-Ｄ-丙氨酸的拆分比率高达2900∶1[9]。
实验时,将酰化-ＤＬ-丙氨酸溶于适量水中,加入适量的米曲酰化酶,在37℃下反应。丙氨酸克分子数达到酰化-ＤＬ-氨基酸克分子数的一半时,酰化-丙氨酸已经完全水解了。用离子交换树脂处理法从酶水解产物中分离Ｌ-丙氨酸和酰化-Ｄ-丙氨酸。然后在水解酰化-Ｄ-丙氨酸,即得到Ｄ-丙氨酸。
②用乙内酰脲水解酶水解ＤＬ-5-取代乙内酰脲。
ＤＬ-丙氨酸与氰酸钾,水加热,生成Ｎ-氨甲酰基-ＤＬ-丙氨酸,再加氢氧化钾作用成环,形成ＤＬ-5-甲基乙内酰脲,再在乙内酰脲水解酶的作用下,水解为氨甲酰基-Ｄ-丙氨酸,最后用重氮法脱去氨甲酰基,此法产物光学活性高,但重氮过程中需使用大量的亚硝酸盐,酸浓度高,亚硝酸挥发,污染环境,损害人体,腐蚀设备[10]。
在上述拆分方法中,结晶法和层析法比较适用于实验室操作。而酶拆分法是比较合适工业生产的。
4 讨 论
建立Ｄ-丙氨酸的工业生产方法,必须考虑以下原则:起始原料易得,产物的光学纯度要高,生产能力要大。在这些原则之下,酶法拆分化学
合成所得的ＤＬ-丙氨酸及其衍生物,在Ｄ-丙氨酸的工业生产中是比较可行的,但要建立Ｄ-丙氨酸的制取过程仍有许多因素需要考虑。反应和催化所需要的酶是其中一个重要因素。酶的活性的保持及酶的回收利用是生产过程中需要解决的问题。随着科学技术的发展,好的测试技术和ＤＮＡ重组技术的结合将使氨基酰化酶催化剂具有严格的立体选择性和高的生物活性。(由于各种原因，没有通知原作者，如原作者不希望在本站张贴你的文章，请来信告知
丙氨酸是构成蛋白质的20种基本氨基酸之一,是血中氮的优良运输工具,又是一种有效生糖氨基酸。Ｄ-丙氨酸包含于大的有机组织中,作为细胞壁肽壁糖或肽抗生素。实验证明,Ｄ-丙氨酸在成年狗尿[1],在微生物体中也大量存在,在弯曲乳杆菌的乙醇提取液中含量高达79%,在瑞士乳杆菌中为59.2%[2]。外源性Ｄ-丙氨酸是随血流进入各组织的。
Ｄ-丙氨酸是白色晶体,有特殊的结晶形状。有甜味,溶于水强碱和强酸溶液,不溶于无水酒精,乙醚和丙酮。加热到熔点,分解生成氨,放出二氧化碳。Ｄ-丙氨酸在2%的盐酸(5ｍｏｌ/Ｌ)中25℃比旋光度是-14.6,在2%的水中25℃比旋光度是-1.8。
2 Ｄ-丙氨酸主要用途
2.1 药物应用
Ｄ-丙氨酸是生产维生素Ｂ6的原料,本身就有镇痛作用,1986年国内药用需量为2.6ｔ。它还可以做成输液注射,单剂合剂[3]。在法国,Ｄ-丙氨酸被用做防止颜面潮红的药物。
近年的研究还发现Ｄ-丙氨酸的新的生理活性的应用。Ｄ-丙氨酸可使体内氨基酸氧化酶(ＤＡＡＯ)在肿瘤细胞质中异位表达,阻止体内脂质氧化损伤,清除细胞毒性[4]。Ｄ-丙氨酸还可以抑制致癌物质二甲基亚硝胺(ＤＭＮＡ),抑制效果为72.4。具有伯胺基的Ｄ-丙氨酸能竞争性地替代仲胺与亚硝酸盐生成ＶＡＮＳｌｙｋｅ反应,分解为氮气和有机酸,从而抑制了ＤＭＮＡ的生成。因此有人建议Ｄ-丙氨酸可以作为一种新的癌基因治疗措施。
2.2 食品添加剂
作为丙氨酸的一种立体构型,Ｄ-丙氨酸具有丙氨酸的一些共性,即在食品添加剂方面的应用,主要供增味剂和调味料用,增加化学调味料的调味效果,改善人工甜味剂的味感,改善有机酸的酸味。
另外,Ｄ-丙氨酸本身具有自己的特性,可以应用在功能性食用甜味剂方面。Ｄ-丙氨酸是强甜味,味感值是4,是氨基酸中最甜的一种[5]。而且Ｄ-丙氨酸是合成二肽甜味剂阿力甜(2.2.4.4-ｔｅａ-ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｅｔａｎｙｌａｍｉｎｅ)一种重要的原料。阿力甜甜味品质好,味道纯正,没有异味和不愉快的后味。而且作为一个二肽,阿力甜只部分参与机体代谢,其最大的产热量为1.4ｋｃａｌ/ｇ,相当于相当甜度蔗糖的0.02%,符合人们目前对低热食品的追求。
2.3 化妆品
Ｄ-丙氨酸有抑菌作用,而且是自然保湿因子(ＮＭＦ)的主要成分,是角质层保持水分的重要角色。
3 丙氨酸的制备方法
由于Ｄ-丙氨酸的生理活性和越来越广泛的应用,它的制取已经引起了很大的兴趣。一般氨基酸的制取方法有三种:水解提取法,微生物发酵法,化学合成法。其中水解提取法一般都得到Ｌ-氨基酸,不适用Ｄ-氨基酸的制取。目前用于制取Ｄ-丙氨酸是其他两种方法,微生物发酵法和化学合成法。
3.1 微生物发酵法
Ｄ-丙氨酸可以通过Ｄ-环丝氨酸抵抗变异种的短杆乳酪酵母制得。但是产物浓度低,生产周期长,设备投资大,有副反应,分离较复杂。而且由于丙氨酸的外消旋的活泼性,产物Ｄ-丙氨酸的光学纯度比较低。
3.2 化学合成法
Ｄ-丙氨酸的化学合成方法有两种,一种是利用不对称合成法直接得到Ｄ-丙氨酸,另一种是通过化学合成法得到ＤＬ-丙氨酸的混旋体,再利用各种光学拆分方法,得到Ｄ-丙氨酸。
3.2.1 不对称合成法
目前有3种不对称合成法适用于合成Ｄ-丙氨酸[7]。
(1)Ｋａｇａｎ-ｃｏｒｅｙ合成法。
选择的手性试剂为含有二环的二氢吲哚,如果使用更拥挤的有两个不对称中心的试剂,Ｄ-丙氨酸的光学纯度可以达到96%。
(2)铑(Ⅱ)络合催化法。
该方法应用的催化剂是Ｒｈ(Ｐｈ3Ｐ)3Ｃｌ(Ｗｉｌｋｉｎ ｓｏｎ催化剂),反应机制相当复杂,是底物与催化剂的立体选择性结合。
(3)Ｅｖａｎｓ合成法。
1986年报导的Ｅｖａｎｓ合成法,是用一个非手性的羧酸与光学纯手性试剂缩合,形成一个中间产物。在碱存在下,中间产物发生烯醇化,并且在手性试剂络合作用下,让亲电试剂定向进攻,得到光学纯的手性产物。
不对称合成法需要纯手性试剂或贵金属络合物作催化剂,成本非常高,反应机制很复杂,不能大规模进行生产,不适用于Ｄ-丙氨酸的大规模制取。
3.2.2 间接化学合成法
化学合成ＤＬ-丙氨酸的方法一般有Ｓｔｒｅｃｋｅｒ法,Ｂｕｃｈｅｒｅｒ-Ｂｅｒｇｅ法。目前工业上生产ＤＬ-丙氨酸的方法主要是由乙醛为原料与氰化钠,氯化铵,氨作用合成2-氨基丙腈,再经过水解后制得ＤＬ-丙氨酸。
化学合成法采用多种原料和工艺路线,成本较低,生产规模大,适应于工业化生产。但所得到的产物皆为ＤＬ-混型丙氨酸,必须进行光学拆分,才可以得到Ｄ-丙氨酸。用于分离ＤＬ-丙氨酸的方法是以下几种。
(1)种晶拆分及诱导结晶法。
在ＤＬ-丙氨酸消旋混合物的饱和溶液中加入Ｄ-丙氨酸晶种和少量表面活性剂,控制浓度和温度,使两种对映体的结晶速度产生差异,Ｄ-丙氨酸优先析出结晶。但工艺较难控制,光学纯度较低。
(2)层析拆分法。
应用高效率化的柱和高性能的高效液相色谱或气相色谱。加入稳定且能定量衍生物的光学活性剂Ｎ-三氟乙酰基正丁烷,通过硅胶毛细管,根据光学活性区分开Ｄ-丙氨酸和Ｌ-丙氨酸[8]。
(3)酶拆分法。
酶有非常严格的专一性,对于外消旋体,酶能选择催化其中一种进行反应而对另一种则几乎不催化。反应多在水溶液中,温和的条件下进行。可以高选择性,高收率的获得所需要的光学活性的氨基酸。目前,应用酶拆分ＤＬ-丙氨酸的衍生物得到Ｄ-丙氨酸的主要有两种方法:
一是用米曲氨基酰化酶拆分ＤＬ-乙酰化丙氨酸,得到Ｄ-丙氨酸。
二是用乙内酰脲水解酶拆分ＤＬ-5-取代乙内酰脲,再用脱去氨甲酰基,得到Ｄ-丙氨酸。
①用米曲氨基酰化酶拆分。
米曲酰化酶是由米曲霉产生的胞外酶,专一水解酰化氨基酸的酰胺键。该酶对Ｎ-乙酰-Ｌ-丙氨酸和Ｎ-乙酰-Ｄ-丙氨酸的拆分比率高达2900∶1[9]。
实验时,将酰化-ＤＬ-丙氨酸溶于适量水中,加入适量的米曲酰化酶,在37℃下反应。丙氨酸克分子数达到酰化-ＤＬ-氨基酸克分子数的一半时,酰化-丙氨酸已经完全水解了。用离子交换树脂处理法从酶水解产物中分离Ｌ-丙氨酸和酰化-Ｄ-丙氨酸。然后在水解酰化-Ｄ-丙氨酸,即得到Ｄ-丙氨酸。
②用乙内酰脲水解酶水解ＤＬ-5-取代乙内酰脲。
ＤＬ-丙氨酸与氰酸钾,水加热,生成Ｎ-氨甲酰基-ＤＬ-丙氨酸,再加氢氧化钾作用成环,形成ＤＬ-5-甲基乙内酰脲,再在乙内酰脲水解酶的作用下,水解为氨甲酰基-Ｄ-丙氨酸,最后用重氮法脱去氨甲酰基,此法产物光学活性高,但重氮过程中需使用大量的亚硝酸盐,酸浓度高,亚硝酸挥发,污染环境,损害人体,腐蚀设备[10]。
在上述拆分方法中,结晶法和层析法比较适用于实验室操作。而酶拆分法是比较合适工业生产的。
4 讨 论
建立Ｄ-丙氨酸的工业生产方法,必须考虑以下原则:起始原料易得,产物的光学纯度要高,生产能力要大。在这些原则之下,酶法拆分化学
合成所得的ＤＬ-丙氨酸及其衍生物,在Ｄ-丙氨酸的工业生产中是比较可行的,但要建立Ｄ-丙氨酸的制取过程仍有许多因素需要考虑。反应和催化所需要的酶是其中一个重要因素。酶的活性的保持及酶的回收利用是生产过程中需要解决的问题。随着科学技术的发展,好的测试技术和ＤＮＡ重组技术的结合将使氨基酰化酶催化剂具有严格的立体选择性和高的生物活性。
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