真菌发酵法产油脂的研究
2007-05-13 14:31:33   来源：食品科学   评论：0 点击：

微生物油脂又称为单细胞油脂，是一种潜在的可应用于工业化的新型油脂资源[1]，其油脂中含有特殊的多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)成分，主要是指γ-亚麻酸(GLA)、α-亚麻酸(ALA)、花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)及二十碳六烯酸(DHA)等。这些多不饱和脂肪酸具有重要的保健功能，已被证实的生理功能有：防治高血压、心脏病，其中有些是大脑和神经系统重要的、不可缺少的营养物质，经过一段时间的食用后可明显提高记忆力和改善睡眠效果；对儿童组的试验则表明这些多不饱和脂肪酸可明显提高儿童智商[2]。多不饱和脂肪酸通常来源于动、植物资源，然而由于种种限制，人们把寻求PUFA的目光转向了微生物资源。利用低等丝状真菌发酵生产PUFA已成为当前国际上发展的趋势[3]。用微生物发酵法生产PUFA，不受原材料和气候限制，生产周期短，工艺简单，成本较低，可以集约化大规模生产，产物含量高，分离提取容易，且油脂成分更接近母乳，营养学上独具特色，因而引起了国内外研究人员的广泛关注。目前利用微生物生产油脂的主要问题之一就是廉价培养基的选择。培养基质是发酵的基础，而其中碳源的用量相对较多，因此，碳源的选择对发酵成本的影响至关重要。目前的研究主要集中在葡萄糖作为发酵的碳源[4]。然而，葡萄糖是价格较贵的原料，从而降低了生产的经济可行性和竞争性。本文研究不同碳源及氮源对被孢霉菌发酵产油脂的影响，旨在初步筛选出适合的廉价的培养基质，并探讨利用玉米淀粉水解糖作为发酵培养基的碳源的可行性，研究微生物油脂的工业化生产的可行性。

1材料与方法

1.1材料深黄被孢霉As3.2793    中国科学院微生物研究所菌种保藏中心。α-淀粉酶、糖化酶(活力为50000U/g)    无锡杰能科生物工程有限公司；酒石酸钾钠、丙三醇、葡萄糖、酵母膏等均为分析纯。

1.2方法

1.2.1培养基斜面培养基(g/L)：20%土豆汁，葡萄糖20，琼脂15，121℃，20min灭菌。种子培养基(g/L)：20%土豆汁，葡萄糖20，磷酸二氢钾3，硫酸镁1.5，pH6，121℃，20min灭菌。基本发酵产脂培养基(g/L)：20%土豆汁，葡萄糖100，磷酸二氢钾3，硫酸镁1.5，维生素B1微量，pH6，121℃，20min灭菌。

1.2.2培养方法菌种接种于斜面培养基，28℃培养3d。无菌水洗下孢子，接种于种子培养基，100ml三角瓶装液10ml，28℃ 140r/min，培养48h。种子液10%(V/V)接种于发酵产脂培养基，500ml三角瓶装液100ml，28℃ 140r/min，培养7d。

1.2.3发酵产脂培养基的优化固定基本发酵培养基的其他成分，改变碳源和氮源。按1.2.2的培养方法进行发酵产脂培养，进行发酵产脂培养基的优化。1.2.3.1碳源的优化(1)玉米淀粉水解糖的制备玉米淀粉调浆→加入α-淀粉酶用量的一半，50℃保温5min→升温至70℃，加入余量的酶→恒温反应至液化结束，测定DE值→100℃/20min灭酶→调pH4.5→60℃加入糖化酶→恒温反应至糖化结束→100℃/20min灭酶[5]

按上述工艺流程制取玉米淀粉水解糖。由前期预试验确定的工艺参数为：35%淀粉乳在70℃，α-淀粉酶添加量为7.5U/g条件下液化17.5min，此条件下液化液的DE值为15.96%；液化后调pH4.5，降温到60℃，添加100U/g糖化酶，糖化24h，获得糖化液的DE值为95.3%。试验中α-淀粉酶、糖化酶活力的测定采用QB/T1803－1993[6]；DE值的测定采用斐林滴定法测定[5]；固形物含量的测定采用阿贝折光仪。(2)碳源种类及其浓度的确定固定100g/L的糖浓度，分别以玉米淀粉水解糖、葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、麦芽糖、D-核糖、半乳糖、海藻糖这9种常见碳源培养深黄被孢霉菌，进行发酵产脂试验。以菌体生物量、油脂含量及油脂产量作为评价指标，选出油脂产量高的作为最佳碳源。然后固定筛选出来的最佳碳源，改变其浓度(60、80、100、120、140g/L)，进行发酵产脂试验，确定其最佳添加浓度。

1.2.3.2氮源的优化选取上述试验确定的最佳碳源及其浓度，分别以酵母膏、蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵、尿素这5种氮源培养深黄被孢霉菌，氮源的添加浓度为3g/L，以菌体生物量、油脂含量及油脂产量作为评价指标，选出油脂产量高的作为最佳氮源。然后改变筛选出来的最佳氮源浓度(2、3、4、5、6、7、8g/L)培养深黄被孢霉菌，确定其最适添加浓度。1.2.4分析检测方法1.2.4.1发酵液残糖量的测定DNS比色法[7]。1.2.4.2菌体生物量(DW)的测定培养好的菌丝体，用布氏漏斗进行减压抽滤，并用蒸馏水反复冲洗3次，取湿菌丝体在80℃过夜烘干至恒重，精确称量菌体生物量[8,9]。

2结果与分析

2.1不同碳源对发酵产脂影响的比较不同碳源发酵生产油脂试验结果见图1。

由图1可知，葡萄糖作为碳源时菌体生物量和油脂产量都最高，分别为12.4960和5.6619g/L，以玉米淀粉水解糖做碳源时次之，其生物量为11.5565g/L，油脂产量为5.4697g/L，其次为麦芽糖和海藻糖。由此可见，当氮源一定，葡萄糖作为碳源时最有利于菌体的的生长和发酵后期油脂的积累。葡萄糖和玉米淀粉水解糖相比较，油脂产量相差0.1922g/L，仅占以葡萄糖为碳源时油脂产量的3.39%。但是玉米淀粉是廉价的原料，因此，综合考虑，确定以玉米淀粉水解糖作为发酵培养基的碳源是可行的。

2.2产脂培养基碳源浓度的确定选取上述试验确定的最佳碳源为玉米淀粉水解糖，改变其浓度，进行发酵产脂试验，试验结果见图2。

由图2可知，发酵过程中，干菌体中油脂的含量随着糖液浓度的增大而增大，这表明，一定的高浓度的还原糖含量对菌体油脂的积累是有益的。当初始糖液浓度低时，由于发酵过程中糖耗尽，菌体生长所需养分不够充足，导致干菌体生物量也低。当初始糖液浓度为60g/L时，发酵后几乎检测不到残糖量。当初糖液浓度为100g/L时，菌体生物量达到最大11.5565g/L。当初糖浓度超过100g/L时，可能是由于培养基中渗透压的影响以及残余的没有消耗的糖的存在，菌体生物量和油脂产量略有下降。初始糖液浓度为120、140g/L的发酵液，发酵后的残糖量分别为26g/L和52g/L，这样也浪费了一部分原料。试验以油脂产量最高作为评价指标。试验确定的玉米淀粉水解糖的最适添加浓度为100g/L。

2.3最佳氮源种类的确定选取上述试验确定的100g/L玉米淀粉水解糖浓度，改变氮源种类，进行产脂发酵试验，结果如图3。由图3可知，酵母膏最有利于菌体生长和油脂积累，其菌体生物量最高为12.3330g/L，油脂产量为6.4366g/L，这可能是由于酵母膏中含有促进菌体生长的其他因子如生长素、维生素等[10]。硫酸铵次之，油脂产量为5.2742g/L。蛋白胨也较有利于深黄被孢霉的生

长，但较不利于油脂积累。尿素不利于深黄被孢霉菌的生长，油脂产量也最低。综合看来，酵母膏作为氮源时既有利于菌体生长，又有利于油脂的合成，因而试验确定酵母膏为最佳氮源。

2.4酵母膏最佳浓度的确定由上述试验确定的玉米淀粉糖100g/L添加量，改变酵母膏的浓度，进行筛选，确定其最适添加浓度，结果如图4。

由图4可知，酵母膏浓度为5g/L时，获得最大的菌体生物量为13.5220g/L，油脂产量也较高，为6.2336g/L。当酵母膏浓度为3g/L时，获得最大的油脂产量为6.4376g/L，生物量为12.350g/L。当酵母膏浓度过高或过低时都不利于菌体的生长和油脂的合成。因此，试验确定酵母膏的最佳浓度为3g/L。2.5验证试验以上述试验确定的结果(基本培养基中添加100g/L玉米淀粉水解糖、3g/L酵母膏)，进行产脂发酵实验，获得的菌体生物量为12.350g/L，油脂含量为52.19%，油脂产量为6.4376g/L；未优化培养基(10%葡萄糖、20%土豆汁)时，菌体生物量为12.4960g/L，油脂含量为45.31%，油脂产量为5.6619g/L。可见，本实验优化的碳源一方面有效的降低了发酵的成本，另一方面，油脂的产量提高了12%。

3结  论

3.1实验确定玉米淀粉水解糖为发酵培养基的最佳碳源，其最适添加浓度为100g/L；酵母膏的最适添加浓度为3g/L。此时菌体生物量为12.350g/L，油脂含量为52.19%，油脂产量为6.4376g/L。

3.2有待于进一步实验优化发酵产脂培养基中的其他营养基质，从而进一步提高油脂含量，并进一步分析其脂肪酸组成。