生孢噬纤维菌荚膜多糖的分离纯化及其性质
2007-05-04 21:37:39   来源：应用与环境生物学报   评论：0 点击：

　　纤维素(cellulose)是地球上最丰富的有机物质,是一类取之不竭、用之不尽的可再生资源.纤维素代谢则是生物圈碳循环的极其重要组成部分,对纤维素生物降解以及纤维素酶学的研究正成为新能源、新食品、新材料开发领域的主要组成部分[1].生孢噬纤维细菌与堆囊菌、噬纤维细菌同属于能够降解纤维素的滑动细菌;它能够在固体表面快速滑动;它们依靠滑动,能够吸附到赖以生长的不溶性纤维素固体介质表面,获取营养,在降解纤维素的同时产生大量的粘性多糖[2].1991年,Coughln[3]等人指出,该菌株产生的多糖具有免疫增强活性等多种生物学功能,可用于开发免疫增强剂和其他多糖类药物.

而到目前为止,还没有对生孢噬纤维细菌菌株的荚膜多糖性质的研究报道;此外,利用生孢噬纤菌降解纤维素合成多糖,也是农作物秸杆资源高值化利用的又一有效途径,具有良好的应用前景.

1　材料与方法

1.1　试验菌株生孢噬纤维菌Sporocytophagasp.JL 01,东北师范大学生命科学学院分离鉴定并保存的菌株[3].

1.2　实验仪器与实验试剂SpectrumGX型红外光谱仪(Perkin-Elmer公司);3400气相色谱仪(Varian公司);J2超速冷冻离心机(BeckmanIn strumentsIncUSA);BSZ 100自动部分收集器(上海沪西分析仪器厂);LC 10Avp高效液相色谱仪(Shimadzu公司);723型可见分光光度计(山东高密彩虹分析仪器有限公司);WXG 6型自动旋光仪(上海光学仪器修理厂);SephadexG 75(瑞典Pharmacia公司);三甲基氯硅烷(Flukachemika公司);六甲基二硅胺烷(上海试剂一厂);右旋糖酐标准品(中国药品生物制品检定所).

1.3　培养基及培养条件

1.3.1　固体培养基　　Mondel盐[4]+1.5%琼脂,pH7.2,上铺一层10cm×1cm的中速滤纸条.

1.3.2　培养方法　　菌体接种于滤纸平板培养基,30℃,培养7～8d后,可用于提取荚膜多糖.

1.4　多糖的分离与纯化

1.4.1　Sporocytophagasp.JL 01的形态观察　　滤纸培养96h的菌体经荚膜染色后于光学显微镜下观察.

1.4.2　荚膜多糖的分离提取[4]　　滤纸平板上培养的生孢噬纤维菌用1%苯酚冲洗2次,每次5mL,洗脱物在室温下剧烈震荡60min,搅拌后向100mL洗脱物中加10g试剂级的硅藻土,混匀后离心1h,取上清,沉淀物中加50mL1%苯酚,按上法离心,合并各次上清.搅拌中加入2%氯化十六烷基吡啶(CPC),直至不再出现沉淀,离心15min,在沉淀中加入300mL2%NaCl,搅拌混合10min,4000r/min离心15min,弃沉淀,上清加3倍体积的95%的乙醇,4℃过夜,次日4000r/min离心30min,再加适量95%乙醇洗涤沉淀物2次,用同法离心,取沉淀溶于100mL水中,溶解的沉淀物置透析袋内用蒸馏水透析72h,换蒸馏水6次,透析袋内液体冻干,为荚膜多糖提取物.

1.4.3　荚膜多糖的纯化　　将荚膜多糖提取物溶解于0.9%的生理盐水中,用SephadexG 75柱分离,同样用0.9%的生理盐水洗脱,上样量3mg/mL,每管收集2.2mL,逐管用苯酚-硫酸法检测糖含量以及用280nm紫外吸收法检测蛋白质含量,收集主糖峰,透析,冷冻干燥后,收集样品.用胰蛋白酶和Sevag法除去蛋白:胰蛋白酶处理后的样品溶于氯仿 1 丁醇(Φ=4 1)混合液中,摇震30min,使蛋白质变性成为不溶性聚集在氯仿和水的界面上,将水相分开后,氯仿相用水洗,洗液与水相合并,重复这样的操作直到氯仿和水的界面没有沉淀为止.

1.5　多糖的分析方法

1.5.1　酚硫酸法测定多糖样品中的糖含量[5]

1.5.2　Folin-酚法测样品中总蛋白含量[6]

1.5.3　多糖的HPLC分析测定纯度　　LC 10Avp高效液相色谱仪(日本岛津);TSK GELG 3000PWXL柱.流动相为0.9%生理盐水,柱温40℃,进样量20μL,流速为0.5mL/min,示差检测器检测.记录色谱曲线和保留时间(Tr).

1.5.4　相对分子量测定　　完全按HPLC测定纯度时的条件,将相对分子量分别为10000,30000,50000,70000,90000的右旋糖酐标准品相继进样,记录各自的保留时间Tr,待测样品相同条件进样,测定多糖相对分子量.

1.5.5　气相色谱法测定多糖组成[7～8]　　(1)甲醇解:彻底干燥的糖样10mg,加入无水盐酸-甲醇2mL,甲醇解80℃,20h,凉至室温后,用无水KOH-甲醇中和至pH为6,然后40℃减压旋转蒸干,常规干燥.(2)硅烷化(T.M.S.衍生物制备):向彻底干燥的甲醇解产物中加入0.2mL无水吡啶(内含饱和甘露醇做内标),75℃溶解30min,然后加入0.3mL硅烷化试剂(六甲基二硅胺烷 三甲基氯硅烷=2 1),摇匀,静止5min,即可取上清进行分析.(3)测定条件:Varian3400气相色谱仪(美国)附FID检测器、HP3365化学工作站,色谱柱:SE 3050mm×0.22mm×0.25μm,载气为高纯N2,气室温度300℃,检测器温度300℃,柱温120℃(2min)→250℃(30min,8℃/min).根据标准单糖与样品的保留时间的比较,确定组成单糖的种类,并根据各峰面积计算出摩尔比.

1.5.6　红外光谱法分析荚膜多糖的结构　　称取5mg样品与150mg溴化钾混合压片,SPECORDIR型红外谱仪常规方法测定.

1.5.7　比旋光度测定　　将纯化后的荚膜多糖溶于不同浓度的乙醇溶液至饱和,分别测定其比旋光度值.2　实验结果2.1　Sporocytophagasp.JL01的荚膜形态观察经荚膜染色,可见菌体周围有一明显的透明圈(图1中箭头所指),即为细菌荚膜.经1%苯酚处理后的菌体完整,但其周围的荚膜不可见或仅有少量残余.由此可知,苯酚处理可以在不破坏菌体的情况下,分离细菌荚膜.

2.2　荚膜多糖性质滤纸平板上的菌体经1%苯酚冲洗、CPC吸附、醇沉及脱水干燥等步骤得到荚膜多糖,荚膜多糖为白色粉末状物质,较难溶于水,水中超声处理0.5h后过夜,次日观察基本溶解,粘度很大.

2.3　荚膜多糖的分离纯化将提取得到的荚膜多糖提取物上SephadexG 75柱层析,0.9%生理盐水洗脱,自动部分收集器收集,酚-硫酸法测糖分布,出现单一对称的多糖峰,多糖峰出现在30～42管之间,最高峰在37管,其值为0.469.同样用紫外分析法测定蛋白分布,得到的蛋白分布图表明同样有单一的蛋白峰出现在30～42管之间,最高峰在37管,其值为0.028(图2),由于蛋白的最高峰与多糖的最高峰重合,并且不含有杂峰,所以认为该蛋白组分是与多糖结合在一起的并且不含有其他游离蛋白.对样品中的总糖含量及总蛋白含量进行测定,发现蛋白含量很少,可采用胰蛋白酶和Sevag法脱去其中的结合蛋白,最终得到成分单一且纯度较好的荚膜多糖样品.

2.4　荚膜多糖的纯度分析

2.4.1　比旋光度测定　　测定溶于不同浓度的乙醇溶液至饱和的样品的比旋光度,其值基本一致,为[a]20D=+51.

2.4.2　高效液相色谱分析　　检查结果(图3)表明,经提取纯化后的荚膜多糖样品无论在分子量上还是在极性方面都比较均一,是一纯度较好的多糖样品.

2.5　纯化后的荚膜多糖的红外光谱分析测定结果见图4.根据红外光谱图可以得出如下结论,该多糖在3432cm-1、1453cm-1处有多糖吸收峰,从在1453cm-1的吸收峰来看,该多糖所含甲基、亚甲基的量比正常多糖多;而其在881cm-1处的峰位显示,其含有不典型β糖苷键特征吸收峰,其分子中有可能同时含有α糖苷键与β糖苷键." 

2.6　纯化后的荚膜多糖的气相色谱分析将荚膜多糖先甲醇解,再硅烷化,制成易挥发的单糖衍生物,进行气相色谱分析,见图5.GC结果表明,荚膜多糖的单糖组成主要为Gal,Glc,GlcA,Man.比值约为3.5 13.3 3.6 1.V

3　结论在实验中,经水提、超滤、浓缩、醇析、常规干燥,获得不含蛋白质等杂质的较纯多糖样品.本研究结果为进一步测定生孢噬纤维菌荚膜多糖的结构,探讨其结构与功能的关系奠定了基础[8].